论文部分内容阅读
痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）曾经作为疫苗预防天花,并帮助人类最终消灭天花。此后,痘苗病毒多被改造为活病毒载体,应用于抗AIDS、流感等感染性疾病及肿瘤的疫苗研究。至今已有多个痘苗病毒为载体的疫苗进入了临床研究阶段。然而,痘苗病毒是一种基因组巨大、基因数量众多的DNA病毒,尚存有许多未知需要深入研究。为适应各种不同应用需要,痘苗病毒还需要进一步改造和优化。痘苗病毒主要形成2种感染形式的病毒颗粒:胞内成熟病毒（intracellular mature virus,IMV）和胞外囊膜病毒（extracellular enveloped virus,EEV）。与占绝大多数的IMV相比,EEV占比小于1%,但具有早释放、早感染、远距离传播等优势。因此,我们推测改变痘苗病毒EEV的释放可能会对病毒的感染及其免疫原性产生影响。EEV的释放包含两个关键步骤:依赖微管的运输以及从细胞膜上的解离。本研究以天坛株痘苗病毒（Tiantan Vaccinia Virus,VTT）为研究对象,选择可能与痘苗病毒EEV释放的两个关键步骤相关的基因进行缺失或突变改造,比较研究了改造后病毒的复制、EEV的释放特性及外源抗原的表达,评估和筛选出能促进抗原免疫应答的新型重组痘苗病毒载体。一,本研究试图通过对病毒依赖微管的运输相关的A36R、F12L基因进行缺失改造,改变病毒依赖微管的EEV释放,从而促进病毒向粘膜基底面的释放。由于F12L基因缺失的重组病毒rVTT△F12L-GFP难以扩增,我们重点分析了A36R基因缺失的重组病毒rVTT△A36R-GFP与野生型VTT在病毒复制和EEV释放方面的差别。体外结果发现,重组病毒rVTT△A36R-GFP在非极化的黏膜上皮细胞Caco-2中的EEV释放和病毒复制能力下降;在极化的Caco-2细胞transwell系统中,病毒向腔面和底侧面的释放均下降。小鼠体内实验结果发现,重组病毒rVTT△A36R-GFP在小鼠鼻和肺组织中复制产生的总病毒量显著减少。上述结果表明:缺失A36R基因导致痘苗病毒EEV释放减少,在粘膜细胞和体内局部的复制下降,不是一种合适的改造方案。二,本研究试图通过对病毒从细胞膜上解离相关的A34R、B5R基因进行点突变改造,从而增加EEV的释放。结果发现与野生型病毒（VTT）相比,重组病毒rVTT-B5Rmut仅能轻微增加EEV的释放和总子代病毒的产生,而rVTT-A34Rmut则能显著增强EEV的释放和总子代病毒的产生。因此,我们以rVTT-A34Rmut为载体,插入HIV env蛋白作为模式抗原,构建了重组HIV疫苗rVTT-A34Rmut-Env。与对照病毒rVTT-Env相比,rVTT-A34Rmut-Env在体外细胞系和小鼠肌肉组织中均显著提高了子代病毒的产生和外源抗原的表达量,并最终在小鼠体内诱导了更强的HIV Env特异性的细胞和抗体应答水平。此外,重组疫苗rVTT-A34Rmut-Env表现出较低的细胞毒性和动物毒性,具有较好的安全性。上述结果表明:能增强EEV释放的重组病毒rVTT-A34Rmut是一种能增强重组疫苗免疫原性的新型重组痘苗病毒疫苗载体。此外,本研究通过对一株已进入临床研究的痘苗病毒载体疫苗VTKgpe的A34R基因点突变改造,有效提高了其诱导的HIV Env特异的抗体应答,证明了A34R点突变也能在其他痘苗病毒载体疫苗中起到增强免疫应答的效应,表明通过A34R基因K151E点突变增强EEV的释放是一种能提高免疫原性的重组痘苗病毒载体改造方案。综上所述,本论文系统研究了改变痘苗病毒本身EEV释放特性的改造方案对重组病毒复制,外源抗原表达和重组疫苗免疫原性的影响。本研究筛选出了一种高效安全的新型VTT疫苗载体rVTT-A34Rmut,并证明了A34R点突变的改造方式同样适用于其他痘苗病毒载体。因此,本研究不仅为如何构建更安全高效的痘苗病毒疫苗载体提供了一个实例,更提供了一种新的思路。