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背景结核病是世界上最致命的传染病之一威胁人类健康安全。在全世界脊柱结核是仅次于艾滋病的致死性疾病,2014年世界卫生组织报道:2013年约900万人患结核病,其中约有150万人因结核致死,全球每年至少花费约80亿美元来应对结核病的流行,目前结核患者数出现耐药、耐多种药[1]甚至广泛耐药据统计在全球正在治疗与新发的结核病例中估计MDR-TB约48万人,其中约有9%的病例为XDR-TB,这使结核的个体化化疗面临严峻挑战。进一步探讨结核的免疫机制,为有效的治疗结核提供理论依据。在西方国家早期治疗结核策略上,将维生素D用于抗结核治疗,在一些疗养院中广泛应用,在当时结核的治疗取得了很好效果,但随着抗结核药物研发与临床应用,25(OH)D3很少被用来抗结核治疗[2,3]。近年来结核耐药被被诊断。许多患者在抗结核的药物使用过程中出现结核耐药[4,5],常规的抗结核药物治疗效果不明显。25(OH)D3的在结核免疫中的作用作用机制,当前已经逐渐引起重视。虽然关于25(OH)D3与结核免疫的的相关文献研究已经很多,但在25(OH)D3对结核的免疫及在结核临床治疗中存在很多争议,没有公认一致的结论。有些报道称25(OH)D3不仅能提高临床治疗结核疗效,还能改善结核患者的影像学表现[6]。然而,有些报道认为25(OH)D3在临床中对提高结核患者的临床效果没有发挥作用。因此,25(OH)D3在结核感染分子免疫与临床抗结核治疗的作用需要更深入的研究。25(OH)D3在结核杆菌感染的免疫过程中发挥着至关重要的作用[9,10]。25(OH)D3影响结核固有免疫的机制已经被明确研究[7,8]有关于25(OH)D3在结核获得性免疫中具体机制的研究还没有深入。结核感染后的获得性免疫启动过程中,树突状细胞(Dendritic cells,DCs)作为机体重要的抗原提呈细胞发挥重要作用[9,10],树突状细胞在结核免疫调节中发挥重要作用。虽然25(OH)D3在树突状细胞成熟中的作用已有广泛报道[18],但结核杆菌感染时,25(OH)D3对树突状细胞影响机制的研究还不够深入。因此,本研究的主要目的为评估小鼠骨髓来源树突状细胞在25(OH)D3存在与不存在的情况下,25(OH)D3对结核杆菌刺激成熟的树突状细胞成熟和调节功能的差异研究。1、建立实验组、阳性对照组、阴性对照组:维生素d正常组、维生素d充足组和维生素d缺乏组,酶联免疫复合技术方法检测各组血清中25(oh)d3水平。2、小鼠骨髓细胞来源树突状细胞的培养及鉴定:扫描电镜、光镜观察细胞形态,细胞流式测量mhc-ii,cd11c,cd86,cd80的表达。3、检测不同条件的三组小鼠骨髓源性树突状细胞表达mhc-ii、cd11c、cd86和cd80的差异。4、测量三组小鼠脾脏淋巴细胞混合反应对t淋巴细胞增殖的影响,cd4+t、cd8+t细胞各自百分比、cd4+t/cd8+t细胞比值。结果1、25(oh)d3在正常组、vd-组和vd+组三组的数据比较中,正常组和vd+组无明显统计学差异。在vd-组中25(oh)d3明显少于正常组。2、通过小鼠骨髓细胞培养分化dc细胞镜下能观察到典型的树枝状突起,细胞流式检测表面分子cd80、mhc-Ⅱ、cd86、cd11c的阳性率平均为84.69%、89.26%、58.94%、87.23%(fig.8);dcs细胞的阳性率高。3、cd11c的比例在对照组、25(oh)d3和25(oh)d3缺乏组分别83.99%±3.20%,81.13%±5.18%and84.46±2.60;共刺激分子的表达在对照组,25(oh)d3和25(oh)d3缺乏组分别是:87.62%±3.23%and84.99%±3.17%85.44±3.41;cd80:85.28%±7.39%and85.11%±8.02%、87.41±6.64;cd86:66.97%±8.29%and52.18%±8.52%、70.87±7.83;对照组中cd86的表达显著高于25(oh)d3组,差异有统计学意义(p<0.05);cd11c、mhc-ii、cd80、cd86平均荧光强度在对照组、25(oh)d3组和缺乏组分别是:cd11c:445.19±129.82and444.21±109.28、439.23±127.64;mhc-ii:1102.16±371.02and681.62±292.71、1012.21±365.12,cd80:350.11±101.18and341.01±113.27、362.08±110.13;cd86:149.18±29.13and139.15±25.91、153.36±26.32,其中对照组的mhc-ii的平均荧光强度值显著大于25(oh)d3组,差异有统计学意义。(p<0.05)4、缺乏组的树突状细胞明显提高了t细胞的增殖水平,检测cd4+tandcd8+t的分布,cd4+t在对照组、25(oh)d3和缺乏组分别是:27.11±0.50and25.31±0.32、33.88±0.52。cd8+t在对照组、25(oh)d3和缺乏组分别是:13.12±0.59and11.50±0.55、17.02±0.52;cd4+t/cd8+t的比值在25(oh)d3组高于对照组,缺乏组低于25(oh)d3组。方法结论1、利用双因素控制小鼠紫外线光照及食物摄入维生素D成功建立维生素D缺乏动物模型。2、结核杆菌感染时,25(OH)D3降低了树突状细胞表面共刺激分子MHC-II和CD86的表达,从而减弱了其抗原提呈能力,抑制了T细胞的增殖。