番茄GRAS转录因子家族基因SlFSR的克隆及其功能研究

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GRAS家族蛋白是植物所特有的转录因子,通常由400-770个氨基酸残基组成,羧基端具有LHR I、VHIID、LHR II、PFYRE和SAW等保守的模体,氨基端序列变化较大。GRAS蛋白家族成员众多,在植物发育、分生组织维持、信号转导和植物抗病过程中起重要的调控作用。但大部分GRAS蛋白的功能尚未阐明。果实是人类及动物的食物和营养物质的重要来源。番茄作为果实成熟研究的模式植物,具有基因组小、遗传转化技术成熟和基因组资源丰富等优点。通过对多种番茄果实成熟突变体的研究,极大地丰富了人们对这一复杂的生理生化变化过程的理解。本研究通过检索PlantTFDB和NCBI数据库,共获得了51个番茄GRAS家族基因。采用Neighbor-Joining法进行进化树分析,将GRAS家族成员分为SHR、SCR、SCL9、PAT1、SCL3、DELLA、SCL4/7、Ls和HAM等九个亚家族。将GRAS家族基因序列与番茄基因组数据库进行比对,发现各基因主要分布在12条染色体两端,且都为单拷贝。在TIGR数据库中选取了6个cDNA文库用于检索预测基因的EST序列,并进行电子表达谱分析,发现SlFSR基因可能在果实成熟过程中特异表达。SlFSR基因是SHR亚家族成员,位于7号染色体上,编码429aa的蛋白质。通过生物信息学分析发现,SlFSR蛋白质序列含有多个潜在的Ser/Thr磷酸化位点和Tyr磷酸化位点,在植物体内其生物活性可能受蛋白翻译后修饰的调控。SlFSR基因启动子上还含多个植物激素应答元件及3个潜在的RIN结合位点。采用Real-time PCR技术分析SlFSR基因在各组织中的表达水平,结果表明SlFSR基因具有果实成熟特异的表达模式。SlFSR基因的表达水平在Nr突变体果实中受到抑制,而在rin突变体果实中几乎不表达,且其表达可受外源乙烯诱导。上述结果表明SlFSR基因可能位于RIN和乙烯信号的下游发挥作用。我们构建了SlFSR基因的RNAi沉默载体,通过农杆菌介导的遗传转化技术获得了5个沉默转基因番茄株系。采用Real-time PCR技术检测转基因番茄株系果实中SlFSR基因沉默效果。结果表明,1-4号沉默株系B+4时期的果实中SlFSR基因的沉默效果分别为97.1%、96.6%、94.4%和96.9%。SlFSR基因沉默后抑制了果实中PG、CEL2和TBG4等果壁代谢基因的表达,并提高了番茄果实的耐贮性。但SlFSR基因沉默的转基因果实中PE1基因的表达水平反而要比对照高。上述结果表明SlFSR基因在番茄果实成熟过程中的作用可能是参与调控果实的软化过程。
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