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肝癌为起始于肝细胞病变的癌症，肝癌有多种类型，肝细胞癌(HCC)是其最主要的类型。肝癌在世界范围内频繁发生，为全球第五大最常见的人类恶性肿瘤。国际上肝癌每年新发病例约63万，发病率和死亡率呈上升趋势，在中国情况最为严重。尽管手术切除合并放疗、化疗和生物治疗应用于肝癌的治疗，但是由于肝癌的复发和进展，肝癌患者的死亡率仍高达20-30％。HCC病变是一个复杂的多步骤的过程，伴随有ECM(细胞外基质)侵袭、血管内渗、侵袭和迁移，最终形成转移性结节。HCC的分子发病机制及预后复杂，人们知之甚少，因此对治疗靶点的检测对HCC患者的临床数据管理及相应治疗有着重要意义。尽管针对HCC的细胞信号事件通路和通路研究进展巨大，但对其生物标志物的研究缺乏，HCC的早期诊断十分困难。为控制HCC的死亡率和进展，其早期诊疗检测标志物的确定亟需确定。近来研究表明，microRNAs在HCC进展中起着重要的作用，为HCC的诊断和治疗研究提供了新的线索。
microRNAs是非编码RNA由RNA聚合酶2和3产生，长度为18-25核苷酸。它们与靶基因的3UTR结合，通过转录后抑制蛋白翻译或降解靶基因mRNA来调控其表达。研究表明microRNAs在肿瘤或癌症的发生发展过程中起非常重要的作用。microRNAs在细胞增殖、分化、转移、凋亡和代谢等关键生物学过程中发挥作用，其异常表达在多种癌症中起抑癌或促癌作用。
研究表明miR-124-3p异常表达与膀胱癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌和食管癌等多种癌症相关。作为基本的脑增强(brain augmented)miRNA，miR-124-3p参与调控神经发育和原肠胚形成。近期报道表明:作为肿瘤抑制因子，miR-124-3p通过靶向ROCK2和EZH2基因起作用;miR-124-3p通过阻断TGF-α诱导的上皮间质转化，减弱前列腺癌细胞的恶性侵袭而抑制肿瘤恶化。但是，miR-124-3p在膀胱癌、乳腺癌、食管癌和胶质母细胞瘤癌中表达水平降低，其水平的降低与胶质母细胞瘤患者预后不良相关，miR-124-3p的“回复”性表达抑制肿瘤细胞的恶性侵袭能力。
CRKL是信号接头CRK蛋白家族成员，是禽肉瘤病毒CT10癌基因同源物，在真核生物中横向表达。CRKL由一个保守的N-末端SH2、一个N-末端SH3和一个C-末端SH3结构域组成，并包括较大的铰链锚定和链接富含脯氨酸的蛋白。CRKL可与BCR-ABL、ABL-1、SOS、BCAR1、C3G、GEF、GAB、Pax等形成复合物，在细胞粘附、增殖、迁移、存活等方面发挥重要作用。CRKL可以通过与下游受体蛋白形成复合物或作为信号启动的上游推动者，协助调控酪氨酸激酶活性或细胞信号转导。CRKL的异常表达与多种癌症的恶性侵袭、EMT和细胞凋亡相关。我们前期报道发现CRKL与小鼠肝癌细胞Hca-P增殖和恶性侵袭有关。然而，miR-124-3p-CRKL轴在HCC中发挥的具体作用及分子调控机制需要深入研究。
目的:
探讨miR-124-3p和CRKL水平变化与HCC的临床相关性。
检测miR-124-3p和CRKL在HCCLM3和Huh7细胞系中的差异表达。
建立miR-124-3p与CRKL的相关性。
考察miR-124-3p和CRKL水平变化对HCCLM3和Huh7增殖、迁移、侵袭、运动和凋亡能力的影响。
探讨miR-124-3p-CRKL轴向调控HCC的分子机制。
方法:
1.采用WB检测HCC临床标本和HCC细胞中CRKL蛋白表达水平，采用qPCR方法检测miR-124-3p和CRKL mRNA表达水平。
2.采用双荧光素酶基因报告实验法分析miR-124-3p对CRKL的靶向性。
3.在HCC细胞中通过瞬时转染过表达miR-124-3p，进而下调CRKL的表达水平。
4.MTT法研究miR-124-3p水平变化对HCC细胞增殖的影响。
5.采用克隆形成实验考察过表达miR-124-3p对HCC细胞克隆形成能力的影响。
6.免疫荧光法检测miR-124-3p过表达对CRKL表达水平的影响。
7.Transwell实验法考察miR-124-3p过表达通过CRKL影响HCC细胞迁移和侵袭能力。
8.创伤愈合实验考察miR-124-3p过表达对在HCC细胞运动能力的影响。
9.采用Western blotting方法检测CRKL和相关信号通路蛋白表达水平。
结果:
1.与癌旁正常肝组织相比，CRKL蛋白表达水平在23例肝癌患者肿瘤组织中显著升高69.5％(P=0.0129)，miR-124-3p表达水平明显降低37.7％(P=0.0453).
2.与正常肝细胞LO2相比:CRKL蛋白和mRNA水平在HCCLM3细胞中高83％(P=0.0314)，17.4-fold(P=0.0164)在Huh7细胞中分别高31％(P=0.0093)和14.7-fold(P=0.0178);miR-124-3-P在HCCLM3和Huh7中水平低74％(P=0.0130)和75％(P=0.0085)。
3.生物信息学分析表明CRKL为miR-124-3p潜在靶基因，3-UTR区域的结合位点为2283-2289和3785-3791。双萤光素酶报告实验:与对照组细胞相比，293T细胞共转染PsiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT和miR-124-3p mimic，荧光素酶活性下降67.9±2.6％(P=0.0002);共转染PsiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT2和miR-124-3p mimic，荧光素酶活性下降53.2±22.4％(P=0.0226)。
4.qRT-PCR实验检测mir-124-3-P过表达对CRKL的影响。与瞬时转染miR-NC组细胞相比:瞬时转染miR-124-3p mimics24，48和72h时，miR-124-3p水平在HCCLM3细胞中升高59347、6699、4363倍，在Huh7细胞中升高3292、29551、2990倍;相应地，CRKLmRNA水平在HCCLM3细胞中分别降低65.56％(P=0.00001)，31.8％(P=0.0002)和无明显变化(ns)，在Huh7中分别降低39.3％(P=0.00001)，72.3％(P=0.0004)and47％(P=0.0058);CRKL蛋白表达在HCCLM3细胞中分别降低67.7％(P=0.00001)，32.7％(P=0.0002)和11.7％(ns)，在Huh7中分别降低65.7％(P=0.0001)，45.7％(P=0.0018)和39.4％(P=0.0025)。
5.免疫荧光染色分析发现:与转染miR-NC组细胞相比，CRKL在miR-124-3p mimics转染HCCLM3和Huh7细胞中表达不明显和低表达。
6.MTT法表征miR-124-3p过表达影响HCC细胞增殖的结果表明:miR-124-3p过表达抑制HCCLM3减少15.58％(P=0.0426)，21.95％(P=0.0110)和31.14％(P=0.0227)时间间隔48，72和96h，和减少10.72％(P=0.162)，11.45％(P=0.0002)，17.02％(P=0.0016)和26.08％(P=0.0004)at24，48，72和96h分别在Huh7跟随miR-124-3p过度表达.
结论:
在本研究中，我们发现在肿瘤组织中miR-124-3p表达不足与CRKL过表达拮抗关联，促进HCC患者的临床进展。并行细胞实验表明:与人正常肝LO2细胞株相比，我们发现在人肝癌HCCLM3和Huh7细胞株中，miR-124-3p表达水平低，CRKL表达水平高。MiR-124-3p直接靶向CRKL。通过与CRKL的3-UTR结合，miR-124-3p过表达引起CRKL在mRNA和蛋白表达降低。我们的结果表明，miR-124-3p过表达的影响肝癌细胞的生长、迁移、侵袭和运动能力。机制研究表明:miR-124-3p引起CRKL表达水平降低，引起ERK通路和EMT进程受抑制和肝癌细胞侵袭和转移能力减弱。miR-124-3p过表达导致ERK通路关键分子RAF、MEK、ERK1/2和pERK1/2和EMT关键促进分子N-cadherin、Vimentin表达水平降低，EMT关键抑制因子E-cadherin水平上升。MiR-124-3p介导的CRKL下调引起BAX/BCL-2比升高，C-JUN降低，通过同时促进细胞凋亡和抑制增殖，进而抑制HCCLM3和Huh7细胞的生长。总之，我们的数据表明miR-124-3p作为一个重要的抑癌miRNA，通过靶向CRKL而抑制HCC的发生和发展。miR-124-3p-CRKL轴向调控通路为癌症的研究、诊断和治疗提供了有一定价值的线索。
microRNAs是非编码RNA由RNA聚合酶2和3产生，长度为18-25核苷酸。它们与靶基因的3UTR结合，通过转录后抑制蛋白翻译或降解靶基因mRNA来调控其表达。研究表明microRNAs在肿瘤或癌症的发生发展过程中起非常重要的作用。microRNAs在细胞增殖、分化、转移、凋亡和代谢等关键生物学过程中发挥作用，其异常表达在多种癌症中起抑癌或促癌作用。
研究表明miR-124-3p异常表达与膀胱癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌和食管癌等多种癌症相关。作为基本的脑增强(brain augmented)miRNA，miR-124-3p参与调控神经发育和原肠胚形成。近期报道表明:作为肿瘤抑制因子，miR-124-3p通过靶向ROCK2和EZH2基因起作用;miR-124-3p通过阻断TGF-α诱导的上皮间质转化，减弱前列腺癌细胞的恶性侵袭而抑制肿瘤恶化。但是，miR-124-3p在膀胱癌、乳腺癌、食管癌和胶质母细胞瘤癌中表达水平降低，其水平的降低与胶质母细胞瘤患者预后不良相关，miR-124-3p的“回复”性表达抑制肿瘤细胞的恶性侵袭能力。
CRKL是信号接头CRK蛋白家族成员，是禽肉瘤病毒CT10癌基因同源物，在真核生物中横向表达。CRKL由一个保守的N-末端SH2、一个N-末端SH3和一个C-末端SH3结构域组成，并包括较大的铰链锚定和链接富含脯氨酸的蛋白。CRKL可与BCR-ABL、ABL-1、SOS、BCAR1、C3G、GEF、GAB、Pax等形成复合物，在细胞粘附、增殖、迁移、存活等方面发挥重要作用。CRKL可以通过与下游受体蛋白形成复合物或作为信号启动的上游推动者，协助调控酪氨酸激酶活性或细胞信号转导。CRKL的异常表达与多种癌症的恶性侵袭、EMT和细胞凋亡相关。我们前期报道发现CRKL与小鼠肝癌细胞Hca-P增殖和恶性侵袭有关。然而，miR-124-3p-CRKL轴在HCC中发挥的具体作用及分子调控机制需要深入研究。
目的:
探讨miR-124-3p和CRKL水平变化与HCC的临床相关性。
检测miR-124-3p和CRKL在HCCLM3和Huh7细胞系中的差异表达。
建立miR-124-3p与CRKL的相关性。
考察miR-124-3p和CRKL水平变化对HCCLM3和Huh7增殖、迁移、侵袭、运动和凋亡能力的影响。
探讨miR-124-3p-CRKL轴向调控HCC的分子机制。
方法:
1.采用WB检测HCC临床标本和HCC细胞中CRKL蛋白表达水平，采用qPCR方法检测miR-124-3p和CRKL mRNA表达水平。
2.采用双荧光素酶基因报告实验法分析miR-124-3p对CRKL的靶向性。
3.在HCC细胞中通过瞬时转染过表达miR-124-3p，进而下调CRKL的表达水平。
4.MTT法研究miR-124-3p水平变化对HCC细胞增殖的影响。
5.采用克隆形成实验考察过表达miR-124-3p对HCC细胞克隆形成能力的影响。
6.免疫荧光法检测miR-124-3p过表达对CRKL表达水平的影响。
7.Transwell实验法考察miR-124-3p过表达通过CRKL影响HCC细胞迁移和侵袭能力。
8.创伤愈合实验考察miR-124-3p过表达对在HCC细胞运动能力的影响。
9.采用Western blotting方法检测CRKL和相关信号通路蛋白表达水平。
结果:
1.与癌旁正常肝组织相比，CRKL蛋白表达水平在23例肝癌患者肿瘤组织中显著升高69.5％(P=0.0129)，miR-124-3p表达水平明显降低37.7％(P=0.0453).
2.与正常肝细胞LO2相比:CRKL蛋白和mRNA水平在HCCLM3细胞中高83％(P=0.0314)，17.4-fold(P=0.0164)在Huh7细胞中分别高31％(P=0.0093)和14.7-fold(P=0.0178);miR-124-3-P在HCCLM3和Huh7中水平低74％(P=0.0130)和75％(P=0.0085)。
3.生物信息学分析表明CRKL为miR-124-3p潜在靶基因，3-UTR区域的结合位点为2283-2289和3785-3791。双萤光素酶报告实验:与对照组细胞相比，293T细胞共转染PsiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT和miR-124-3p mimic，荧光素酶活性下降67.9±2.6％(P=0.0002);共转染PsiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT2和miR-124-3p mimic，荧光素酶活性下降53.2±22.4％(P=0.0226)。
4.qRT-PCR实验检测mir-124-3-P过表达对CRKL的影响。与瞬时转染miR-NC组细胞相比:瞬时转染miR-124-3p mimics24，48和72h时，miR-124-3p水平在HCCLM3细胞中升高59347、6699、4363倍，在Huh7细胞中升高3292、29551、2990倍;相应地，CRKLmRNA水平在HCCLM3细胞中分别降低65.56％(P=0.00001)，31.8％(P=0.0002)和无明显变化(ns)，在Huh7中分别降低39.3％(P=0.00001)，72.3％(P=0.0004)and47％(P=0.0058);CRKL蛋白表达在HCCLM3细胞中分别降低67.7％(P=0.00001)，32.7％(P=0.0002)和11.7％(ns)，在Huh7中分别降低65.7％(P=0.0001)，45.7％(P=0.0018)和39.4％(P=0.0025)。
5.免疫荧光染色分析发现:与转染miR-NC组细胞相比，CRKL在miR-124-3p mimics转染HCCLM3和Huh7细胞中表达不明显和低表达。
6.MTT法表征miR-124-3p过表达影响HCC细胞增殖的结果表明:miR-124-3p过表达抑制HCCLM3减少15.58％(P=0.0426)，21.95％(P=0.0110)和31.14％(P=0.0227)时间间隔48，72和96h，和减少10.72％(P=0.162)，11.45％(P=0.0002)，17.02％(P=0.0016)和26.08％(P=0.0004)at24，48，72和96h分别在Huh7跟随miR-124-3p过度表达.
结论:
在本研究中，我们发现在肿瘤组织中miR-124-3p表达不足与CRKL过表达拮抗关联，促进HCC患者的临床进展。并行细胞实验表明:与人正常肝LO2细胞株相比，我们发现在人肝癌HCCLM3和Huh7细胞株中，miR-124-3p表达水平低，CRKL表达水平高。MiR-124-3p直接靶向CRKL。通过与CRKL的3-UTR结合，miR-124-3p过表达引起CRKL在mRNA和蛋白表达降低。我们的结果表明，miR-124-3p过表达的影响肝癌细胞的生长、迁移、侵袭和运动能力。机制研究表明:miR-124-3p引起CRKL表达水平降低，引起ERK通路和EMT进程受抑制和肝癌细胞侵袭和转移能力减弱。miR-124-3p过表达导致ERK通路关键分子RAF、MEK、ERK1/2和pERK1/2和EMT关键促进分子N-cadherin、Vimentin表达水平降低，EMT关键抑制因子E-cadherin水平上升。MiR-124-3p介导的CRKL下调引起BAX/BCL-2比升高，C-JUN降低，通过同时促进细胞凋亡和抑制增殖，进而抑制HCCLM3和Huh7细胞的生长。总之，我们的数据表明miR-124-3p作为一个重要的抑癌miRNA，通过靶向CRKL而抑制HCC的发生和发展。miR-124-3p-CRKL轴向调控通路为癌症的研究、诊断和治疗提供了有一定价值的线索。