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目的:成釉细胞瘤(ameloblastoma,AB)作为颌骨内最常见的牙源性肿瘤之一,具有局部侵袭性及易复发的生物学行为。AB早期症状不明显,临床治疗常采取刮治术或囊肿开窗术治疗,导致部分AB的复发,进而引起AB的溶骨性生长,此时常采取病灶扩大切除术及颌骨节段切除,极大地影响患者术后的生存质量。AB作为一种上皮来源的牙源性肿瘤,其复发率高达70%,而病灶转移率也高达2%。第四版《WHO头颈部肿瘤新分类》(2017年)中将AB分为经典型、单囊型、骨外/外周型以及转移性AB,其中实性/多囊型及促结缔组织增生型AB统称经典型AB(conventional ameblastoma),且新增了转移性AB这一分类。环状RNA(circular RNAs,circ RNAs)是一类不同于普通的5’-3’端线性RNA结构,具有首尾相接呈闭合环状结构的非编码RNA(non-coding RNAs,nc RNAs),其广泛存在于真核转录组中且不易被RNA酶降解。circ RNA主要在转录水平及转录后水平参与多种信号通路及下游分子的调控,从而在肿瘤的发生、发展等病理进程中发挥重要的调节作用。circ RNA具有高度保守性及稳定性、表达的空间性、时效性和组织特异性,因此在临床实践中可以作为肿瘤诊断的潜在生物标志物及治疗靶点。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一种含有19-25个碱基的非编码RNA分子,通常在转录后水平通过促进信使RNA(messenger RNA,m RNA)降解、切割特定位点或抑制转录后翻译进而调控基因表达。miRNA的功能主要为在转录后水平负向调控靶基因,尤其通过与3’UTR位点的特异性结合调控m RNA或通过结合m RNA的编码序列促进m RNA特定位点的切割,进而调控细胞分化、迁移、凋亡、维持细胞稳态等多种生理过程。在肿瘤的发生发展中,miRNA既可作为肿瘤抑制因子也可作为肿瘤促进因子,调控肿瘤不同阶段的病理进程。CTNND1,也称p120-catenin(p120),其既可作为原癌基因也可作为抑癌基因在多种疾病与肿瘤中发挥不同生理、病理作用,且主要通过与经典型与II型钙黏蛋白的细胞质尾部相互作用来调节细胞粘附。CTNND1在多种肿瘤中通过影响肿瘤细胞的细胞黏附和极性,从而影响肿瘤增殖、侵袭、迁移等特征。研究表明CTNND1基因敲除的小鼠在口腔、食道和胃部发现癌前病变以及肿瘤病灶。本研究旨在通过对circ RNA芯片数据进行筛选,对其进行组织定量检测,并验证其下游可能与其存在结合位点的miRNA及m RNA,在此基础上构建竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)网络,深入探讨该网络轴对AB进展的影响,为AB的发生发展机制以及诊断治疗提供潜在的新方向。研究方法:1.对circ RNA芯片数据进行筛选,根据其表达以及功能预测筛选具有差异表达和特异性调控的潜在circ RNA靶点,并对其进行组织定量验证;2.进一步验证下游可能与其存在结合位点的miRNA及m RNA,以相应芯片数据进行验证,借助生物信息学手段预测其功能富集以及通路富集;3.应用免疫组织化学染色技术检测CTNND1在AB组织中的表达情况;4.核质分离实验鉴定hsa_circ_0000517分别在细胞核以及细胞浆中的表达;5.体外培养HAM1细胞系,通过沉默hsa_circ_0000517观察对hsa-miR-1296表达的影响,并通过划痕实验,transwell invasion实验观察沉默hsa_circ_0000517对AB迁移、侵袭特性的影响;6.过表达/抑制hsa-miR-1296观察CTNND1转录水平以及翻译水平的变化,借助划痕实验,transwell invasion实验观察过表达/抑制hsa-miR-1296对AB迁移、侵袭特性的影响,通过荧光素酶报告实验验证靶基因间的结合;7.通过构建沉默hsa_circ_0000517/NC同时沉默hsa-miR-1296/NC的回复实验模型检测hsa-miR-1296及CTNND1的表达水平;借助划痕实验、transwell invasion实验观察回复实验模型对AB迁移、侵袭特性的影响。结果:1.在表达差异倍数最高/最低的各60个circ RNA中筛选外显子来源,可能存在于胞浆且功能可能与肿瘤发生发展相关的circ RNA,最终筛选出6个circ RNA(hsa_circ_0089153,hsa_circ_0001955,hsa_circ_0080425,hsa_circ_0000517,hsa_circ_0043278,hsa_circ_0001667)。RT-PCR验证6个circ RNA在AB组织中呈差异表达;2.借助生物信息学手段预测下游miRNA及m RNA,其功能富集以及通路富集,进一步构建ceRNA网络,发现hsa-miR-1296与hsa_circ_0000517结合的可能性较高。应用miRDB数据库,miRWalk数据库,Target Scan数据库预测可能与hsa-miR-1296存在潜在结合位点的m RNA,三个数据库取交集筛选出124个m RNA,发现CTNND1与AB发生发展密切相关。至此,初步确定研究对象为hsa_circ_0000517/hsa-miR-1296/CTNND1轴;3.应用免疫组织化学染色对AB组织样本进行CTNND1表达情况检测,并用半定量方法进行统计分析,结果显示CTNND1表达与AB患者年龄以及AB病理分型相关(P<0.05),且肿瘤发病部位主要与丛状型AB相关(P<0.05)。CTNND1在AB中主要表达于胞浆;4.核质分离实验结果显示hsa_circ_0000517在细胞核和细胞浆中均有表达;5.构建hsa_circ_0000517瞬时转染沉默模型,沉默hsa_circ_0000517后,hsa-miR-1296的表达水平明显增高(P<0.05),人成釉细胞瘤细胞HAM1迁移与侵袭能力明显增强(P<0.0001);6.构建hsa-miR-1296 mimics/inhibitor/NC瞬时转染模型,hsa-miR-1296 mimics组CTNND1表达明显降低(P<0.0001),hsa-miR-1296 inhibitor组观察到CTNND1表达明显升高(P<0.05)。miR-1296-mimics组CTNND1蛋白表达水平较NC组明显表达降低(P<0.05),miR-1296-inhibitor组较miR-1296-mimics组CTNND1表达明显升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示hsa-miR-1296/CTNND1间存在结合。在hsa-miR-1296 mimics/inhibitor/NC瞬时转染模型中,hsa-miR-1296 mimics明显促进HAM1迁移(P<0.001),且hsa-miR-1296 mimics组HAM1的迁移能力明显强于hsa-miR-1296 inhibitor组(P<0.05);hsa-miR-1296 mimics明显增强了HAM1的侵袭能力(P<0.0001),且hsa-miR-1296 mimics组的侵袭能力明显强于hsa-miR-1296 inhibitor组(P<0.0001);7.构建沉默hsa_circ_0000517/NC同时沉默hsa-miR-1296/NC的回复实验,沉默hsa_circ_0000517后hsa-miR-1296表达明显增高(P<0.05),CTNND1表达明显降低(P<0.01);沉默hsa-miR-1296后hsa-miR-1296表达明显降低(P<0.0001),而CTNND1表达明显升高(P<0.01);回复实验组(si-circ_0000517+miR-1296-inhibitor)hsa-miR-1296与CTNND1的表达水平较NC组均无明显差异。构建沉默hsa_circ_0000517/NC同时沉默hsa-miR-1296/NC的回复实验模型观察AB迁移能力及侵袭能力的变化,结果显示沉默hsa_circ_0000517明显增强了HAM1的迁移能力(P<0.0001),回复实验组也观察到促进HAM1的迁移能力(P<0.01),沉默hsa_circ_0000517明显增强HAM1的侵袭能力(P<0.0001)。结论:1.Hsa_circ_0000517在人成釉细胞瘤中差异表达,且hsa-miR-1296可能与hsa_circ_0000517具有潜在结合位点,存在调控作用;Hsa-miR-1296/CTNND1存在潜在结合位点,且CTNND1在AB中主要表达于胞浆;Hsa_circ_0000517/hsa-miR-1296/CTNND1轴可能在人成釉细胞瘤中调控其病理过程;2.沉默hsa_circ_0000517后,hsa-miR-1296表达明显升高,CTNND1表达明显降低,AB侵袭、迁移能力明显增强;抑制hsa-miR-1296后,CTNND1表达明显升高;hsa-miR-1296过表达后,CTNND1表达明显降低,AB侵袭、迁移能力明显增强;3.Hsa_circ_0000517/hsa-miR-1296/CTNND1轴对AB侵袭、迁移具有调控作用。