背景与目的p21 activated kinase1（PAK1）即p21小GTP酶活化激酶1,一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAK1是PAK家族中与人类肿瘤关系密切的成员,以二聚体形式存在,是小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化。多项研究提示PAK1主要还是通过影响MAPK及NF-κB等通路来发挥生物学效应。正常组织只在脑、肌肉和脾脏中检测到PAK1表达,其他组织表达很少；但在多种人类肿瘤中可见PAK1表达增高或过度活化。已有文献及我们的前期工作发现在正常肠粘膜向大肠癌的恶性演进过程中,在大肠腺瘤中就可以看到PAK1明显的高表达。这说明PAK1可能参与了大肠癌恶性演进发生的启动阶段,对大肠癌的发生发展起重要作用。而肿瘤细胞的过度生长是恶性演化启动阶段的典型事件。目前缺乏PAK1在大肠癌恶性增殖的关系及相关分子机制的研究。因此,本课题旨在研究PAK1在大肠癌增殖中的作用,并从体内和体外两方面探讨PAK1促进大肠癌细胞恶性增殖的机制。这对于明确大肠癌发生发展分子机制,为大肠癌的早期诊断和个体化治疗寻找新的分子标志都具有重要的意义。材料和方法1、主要材料SW480、SW620、SW1116及LoVo大肠癌细胞株,真核细胞表达质粒pcDNA3.1-PAK1-T423E, pGPU6/GFP/Neo PAK1 shRNA, LipofectamineTM 2000, G418, PAK1、Cyclin D1、CDK4、CDK6、SAPK/JNK、phospho-SAPK/JNK （Thr183/Tyr185）等抗体,MEK1/2抑制剂U0126,p38 MAPK抑制剂SB203580,JNK抑制剂SP600125,10只SPF级BALB/c裸小鼠。2、主要方法2.1 PAK1 shRNA干扰载体的构建从GenBank中选定人类PAK1编码基因PAK1 mRNA序列（NM₀01128620）,依照shRNA的设计原则,设计4条shRNA片段,并设计一对非相关核苷酸序列作为阴性对照,利用BLAST在EST数据库查询,均未发现与另外任何基因同源,pGPU6/GFP/Neo shRNA表达载体的制备交由上海吉玛制药有限公司完成。2.1.2 CCK-8法检测细胞增殖接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔100μl RPMI-1640完全培养基含2000（增殖实验）或3000（增殖抑制实验）个细胞,每组设6个复孔,不同处理时间后,加入CCK-8溶液10μl,继续培养2h后在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线,实验重复两次,数据以mean±SD表示。2.2流式细胞术检测细胞周期将经过血清饥饿同步化之后或者SP600125处理的细胞用0.25%胰酶将细胞从培养瓶底消化下来,1200转离心5min。用lxBuffer A洗涤细胞一次（2000转,5min）,收集并调整细胞浓度为1×106/mL。细胞加9倍体积预冷的70%乙醇,于20℃固定24小时。离心收集细胞后,用1xBuffer A洗细胞以除去乙醇,细胞重悬于500μl BufferA中。加入12.5μl RNaseA（终浓度为0.25mg/ml）,37℃反应30min。加入5μl PI室温避光染色30min。流式细胞仪激发波长488nm处检测细胞周期含量。2.3流式检测细胞凋亡用0.25%胰酶将LoVo细胞的干扰组及对照组细胞从培养瓶底消化下来,1200转离心5min,细胞计数；各组细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板,每组设3个复孔；接种后24h细胞密度为80%时,更换培养基,各孔加入0.2%FBS的低血清培养基饥饿48h诱导细胞凋亡；血清饥饿法诱导细胞凋亡48小时后,用0.25%胰酶（不含EDTA）将六孔板上的细胞消化下来（消化时间不易过长,否则容易引起假阳性）；用PBS洗涤细胞二次（2000转离心5min）,收集1-5×105细胞；吸取500ul 1X Binding Buffer加入到细胞悬液里；然后加入5μl的Annexin V-PE和10μl的7-AAD；室温、避光、反应5-15min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.4软琼脂克隆形成实验用RPMI 1640配制5%琼脂糖（Gibco）高压消毒备用,用前加热到到凝胶完全融化并50℃保温,加37℃预热的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液到工作浓度；底层琼脂糖凝胶中琼脂糖终浓度为0.5%,每直径3.5cm的培养皿加1ml上层凝胶琼脂糖终浓度为0.33%,余同底层胶,直径3.5cm的培养皿加1 ml；细胞悬液制备：取对数生长期的各组细胞,0.25%胰酶消化,镜下计数,加入到上层凝胶到浓度为500/ml,每孔约500个细胞每种细胞设三个平行对照,以转染空载体的LoVo为阴性对照；凝胶在室温完全凝固后,培养皿加含双抗的10%FCSRPMI-1640 2ml,37℃5%CO2培养。每3-4天拿出培养皿冷却到室温,更换培养基,至21天终止。结果判定：大于50个细胞的克隆为有效克隆,计算有效细胞克隆数并分析结果。2.5裸鼠成瘤实验LoVoshRNA和LoVoshRNA/NC细胞消化传代,培养至对数生长期,密度约为80%；台盼蓝证实细胞活力>95%,用RPMI 1640制备2×107/ml细胞悬液；10只BALB/c裸鼠,无菌条件下饲养,随机分为2组,每组5只；注射0.2ml细胞悬液于裸鼠腋部背侧皮下,均在半小时内完成；裸鼠成瘤1个月,每3天测量一次瘤体体积。2.6 Western blotting提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,按《分子克隆》第三版的配方配制10%蛋白电泳分离胶和5%积层胶,蛋白变性上样,上样量30μg,恒压100V电泳约3h,2mA/cm2,60min恒流半干电转膜,5%的脱脂奶粉/TBS-T室温封闭1h,5%的脱脂奶粉/TBS-T 1:500稀释相应的一抗,与PVDF膜4℃孵育过夜,TBS-T洗涤,同样方法1:2000-5000稀释HRP标记二抗,室温1h,TBS-T洗涤后,ECL化学发光法检测,Quantity one （Bio-Rad）软件半定量分析。2.7、统计学分析结果均经SPSS 13.0软件统计分析。流式细胞术实验结果取三次结果的平均值,Western blotting进行灰度扫描后将实验组换算成对照组的相对百分数进行统计,比较采用方差分析（one-way ANOVA）,多重比较采用LSD法；增殖实验和增殖抑制实验的结果取三次实验结果中的一次作为统计结果；所有的统计结果以P<0.05作为有统计学意义；参数比较前进行方差齐性检验,在方差齐性的基础上进行比较。结果1沉默PAK1对大肠癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响1.1稳定表达用于抑制PAK1表达的质粒及其对照质粒的大肠癌细胞的建立和鉴定表达PAK1 shRNA（789、823、1079、1140）的载体和表达无意义shRNA（NC）的载体分别转染LoVo细胞株,用G418筛选稳定克隆,筛选出的干扰组细胞分别命名为LoVo shPAK1/789、LoVo shPAK1/823、LoVo shPAK1/1079、LoVo shPAK1/1140。筛选出的阴性对照组细胞均命名为Control。经过Western Blotting鉴定稳定克隆构建成功后LoVo细胞的干扰效率。经方差分析（One-Way ANOVA）结果显示,LoVo shPAK1/789及LoVo shPAK1/823干扰组细胞PAK1表达量明显下降（P<0.05）。组间多重比较结果显示LoVo PAK1/789细胞干扰效率最高,选择该组质粒转染的细胞进行下一步研究。1.2 PAK1表达缺失可以抑制大肠癌细胞增殖为了研究PAK1表达缺失是否能够抑制大肠癌细胞的增殖,PAK1shRNA稳定干扰细胞株构建成功后,将细胞接种于96孔板,采用CCK-8法观察PAK1表达缺失对大肠癌LoVo细胞0-72h的细胞增殖的影响。结果显示,LoVo细胞培养后48h、72h后,干扰组细胞生长速度明显低于对照组细胞。经独立样本t检验结果显示,与对照组细胞相比,LoVo干扰组细胞生长速度减慢且有显著性意义（P<0.05）。说明干扰PAK1蛋白表达后可以明显抑制大肠癌LoVo细胞的增殖。1.3 PAK1表达缺失可以引起大肠癌细胞周期阻滞为了研究PAK1表达缺失引起的大肠癌细胞增殖受抑制与细胞周期的关系,在PAK1shRNA稳定干扰细胞株构建成功后,采用PI标记的流式细胞术检测大肠癌LoVo细胞的细胞周期变化。经独立样本t检验分析结果显示,与对照组细胞相比LoVo干扰组细胞的G1期细胞数量明显增多,细胞周期进程减慢（P<0.05）。同时我们发现LoVoshPAK1细胞中CyclinD1,CDK4/6的表达较LoVoshPAK1/NC明显减少（P<0.05）。这些结果说明PAK1可促进大肠癌LoVo细胞CyclinDl,CDK4/6的表达,促进细胞由G1期向S期的周期转换,从而导致大肠癌细胞的恶性增殖。1.4 PAK1表达缺失可以增加大肠癌细胞对血清饥饿诱导的细胞凋亡的敏感性为了研究PAK1表达缺失对大肠癌细胞凋亡的影响,在PAK1shRNA稳定干扰细胞株构建成功后,将细胞接种于6孔板,LoVo细胞用血清饥饿法诱导凋亡,用AnnexinV-PE标记及7AAD复染细胞后行流式细胞术检测细胞凋亡率。经独立样本t检验分析结果显示,经血清饥饿48h诱导凋亡后,对照组细胞未出现明显凋亡,而干扰组细胞则出现明显的凋亡细胞（P<0.05）。这些结果说明PAK1蛋白表达缺失后可使得大肠癌LoVo细胞对血清饥饿诱导的凋亡变得敏感。1.5软琼脂克隆形成实验为了证实PAK1对肿瘤的恶性潜能具有调控作用,我们采用软琼脂集落形成实验检测PAK1干扰前后单个LoVo细胞的非锚定依赖性生长的差异,结果表明：与对照组细胞比较,PAK1沉默的LoVo细胞克隆形成能力降低（P<0.05）。1.6沉默PAK1基因对LoVo细胞裸鼠成瘤的影响为了进一步证实PAK1对大肠癌增殖、周期的调控作用,我们进行了裸鼠成瘤实验。LoVoshRNA组裸鼠瘤体体积显著小于LoVoshRNA/NC组裸鼠瘤体体积。提示沉默大肠癌LoVo细胞中PAK1的表达可以显著抑制LoVo细胞裸鼠成瘤能力。2 PAK1表达缺失参与大肠癌细胞相关生存信号通路的研究通过Western-Blot检测PAK1参与细胞增殖信号通路蛋白的变化。结果提示,与阴性对照组细胞相比,转染干扰载体的LoVo细胞JNK activity明显下降（P<0.05）。与阴性对照组细胞相比,转染干扰载体的LoVo细胞的细胞周期相关蛋白cyclin D1、cdk4、cdk6表达降低且有显著性意义（P<0.05）。JNK特异性抑制剂SP600125可以显著的抑制PAK1对细胞周期相关蛋白cyclinD1、cdk4/6表达的影响（P<0.05）。结论沉默PAK1表达可以抑制大肠癌LoVo细胞的增殖（P<0.05）。沉默PAK1可以引起大肠癌LoVo细胞G1期阻滞,延缓细胞周期的进程,抑制细胞的恶性增殖。沉默PAK1表达可以抑制大肠癌LoVo细胞非锚定依赖性生长的能力及裸鼠成瘤能力。PAK1可通过抑制细胞凋亡而引起大肠癌的恶性增殖。PAK1加快细胞周期进程的机制可能是通过调控G1/S期监测点相关重要蛋白的表达来实现的。沉默PAK1可抑制大肠癌LoVo细胞CyclinD1、CDK4/6的表达,延缓细胞增殖的倍增时间,抑制大肠癌细胞的恶性增殖。沉默PAK1表达可以增加对大肠癌LoVo细胞对血清饥饿法诱导凋亡的敏感性。PAK1通过激活JNK信号通路,从而促进CyclinD1及CDK4/6的表达,导致大肠癌细胞的恶性增殖及细胞周期进程加速。