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目的:益气除痰法为导师周岱翰教授治疗脾虚痰湿型非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的基本治法,清金得生方(Qing Jin De Sheng Fang,QJDSF)作为代表方之一,在临床上疗效显著,其片剂为广州中医药大学第一附属医院的院内制剂。本研究拟客观评价清金得生片(Qing Jin De Sheng Pian,QJDSP)的临床疗效,研究其抗肿瘤作用的分子机制。通过回顾性临床试验客观评价QJDSP联合化疗治疗NSCLC患者的临床疗效。通过细胞实验、动物实验研究QJDSP的抗肿瘤作用。通过网络药理学、转录组测序探究QJDSP治疗NSCLC的分子机制并进行相关验证。方法:1.QJDSP联合化疗治疗中晚期NSCLC患者的回顾性临床试验检索近十年在广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心进行化疗的的NSCLC患者,根据纳排标准对患者进行筛选,依据患者是否在化疗期间服用QJDSP将患者分为治疗组和对照组,收集患者治疗前后的临床信息,对QJDSP联合化疗的疗效进行客观评价。2.QJDSF溶液对NSCLC细胞A549和H1650功能的影响通过MTT实验检测QJDSF溶液对NSCLC细胞A549和H1650、人正常肺上皮细胞beas-2b增殖的影响,并计算半数抑制率(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。通过细胞划痕实验和Tranwell小室迁移实验检测QJDSF溶液对NSCLC细胞A549和H1650迁移能力的影响。通过Transwell小室侵袭实验检测QJDSF溶液对NSCLC细胞A549和H1650侵袭能力的影响。通过Annxin V/PI染色实验检测QJDSF溶液对NSCLC细胞A549和H1650细胞凋亡的影响。3.QJDSP对NSCLC细胞A549移植瘤裸鼠的药效实验建立NSCLC细胞A549裸鼠移植瘤模型,模型建立之后随机分为对照组(0 mg/kg QJDSP)、低剂量组(0.555mg/kg QJDSP)、中剂量组(1.11mg/kg QJDSP)、高剂量组(2.22mg/kg QJDSP)及阳性药组(2mg/kg顺铂),每三天对裸鼠瘤体大小及体重进行测量,给药21天后,眼眶取血并脱颈椎处死,分离瘤体和脏器并称重。将各组裸鼠的肝脏、肾脏、瘤块做病理切片,通过HE染色观察组织形态。使用各组裸鼠的血清对与肝肾功能相关的指标进行检测。4.通过网络药理学、转录组测序探究QJDSP治疗NSCLC的分子机制并进行相关验证通过TCMSP数据库查找QJDSP的作用靶点,并通过Dig See、Dis Ge NET、Drug Bank、Genecards、OMIM、pharm GKB、TTD数据库查找NSCLC的治疗靶点。将QJDSP的作用靶点与NSCLC的治疗靶点取交集后,进一步通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析探究QJDSP治疗NSCLC的分子机制。通过转录组测序对对照组和高剂量组裸鼠瘤体的m RNA建库测序,通过GO和KEGG富集分析探究QJDSP治疗NSCLC的分子机制。将两者的KEGG富集分析结果取交集,进一步明确QJDSP抗肿瘤作用的分子机制。将A549和H1650细胞分别分为对照组(0mg/ml QJDSF),高剂量组(0.08mg/ml QJDSF),高剂量+p53抑制剂组(0.08mg/ml QJDSF+10μM/ml pifithrin-μ),通过Annexin V/PI染色实验检测各组的细胞凋亡情况。将A549和H1650细胞分别分为对照组(0mg/ml QJDSF),低剂量组(0.02mg/ml QJDSF),高剂量组(0.08mg/ml QJDSF),高剂量+p53抑制剂组(0.08mg/ml QJDSF+10μM pifithrin-μ),干预24H后,提取各组A549和H1650细胞的蛋白,使用免疫印迹(Western blotting,WB)实验对p53信号通路上的p53、bcl-2、bax、cytc、pro-caspase 3、cleaved caspase 3蛋白的表达量进行检测。通过WB实验检测各组裸鼠瘤体组织中p53信号通路上相关蛋白的表达量。使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Q-PCR)实验检测各组瘤体组织中p53信号通路的相关基因m RNA的表达量。结果:1.QJDSP联合化疗治疗中晚期NSCLC的回顾性临床试验对近十年在广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心化疗的NSCLC患者进行检索并筛选,共纳入221名患者,其中治疗组116名,对照组105名。统计分析发现两组患者治疗前的基线基本一致,治疗后治疗组的患者的卡氏评分(Karnofsky performance status,KPS)明显高于对照组,且有统计学差异(P<0.05)。治疗后治疗组的患者的客观缓解率和疾病控制率高于对照组,但无统计学差异(P>0.05)。2.QJDSF溶液对NSCLC细胞A549和H1650功能的影响MTT结果表明QJDSF溶液对A549、H1650、beas-2b细胞的抑制作用与时间和浓度呈现出正相关的趋势,抑制作用的增强与药物浓度的提高以及干预时间的延长有关。NSCLC细胞A549的24H、48H、72H IC50分别为0.124mg/ml、0.062mg/ml、0.041mg/ml,NSCLC细胞H1650的24H、48H、72H IC50分别为0.094mg/ml、0.077mg/ml、0.037mg/ml,人正常肺上皮细胞beas-2b的24H、48H、72H IC50分别为4.571mg/ml、1.833mg/ml、1.602mg/ml。细胞划痕实验、Transwell小室迁移实验及侵袭实验结果表明QJDSF溶液可以抑制NSCLC细胞A549和H1650的迁移及侵袭能力,抑制作用与浓度呈现出正相关的趋势,组间差异皆有统计学意义(P<0.05)。通过Annexin V/PI染色实验观察到QJDSF溶液能够增加NSCLC细胞A549和H1650的早期凋亡细胞比例,且随着浓度的增加,早期凋亡细胞的比例上升,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。3.QJDSP对NSCLC细胞A549移植瘤裸鼠的药效试验动物实验结果表明,中、高剂量组剥离的瘤体体积小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。瘤体HE染色发现所有肿瘤细胞经过染色皆为核大深染,异型明显,药物干预组与模型组比较,肿瘤细胞数量、核分裂数量相对较少,细胞分布相对松散。治疗后中、高剂量组裸鼠体重上升,中药各组裸鼠的体重与阳性药组比较皆具有统计学意义(P<0.05)。计算NSCLC细胞A549移植瘤裸鼠的主要脏器指数,各组的心指数、肺指数、肾指数之间的差异无统计学意义(P>0.05)。阳性药组裸鼠的肝指数和脾指数明显低于其他4组,且具有统计学差异(P<0.05)。通过检测NSCLC细胞A549移植瘤裸鼠的肝肾功能,各组裸鼠的谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate Transaminase,AST)间的差异无统计学意义(P>0.05)。QJDSP低、中、高剂量组的UREA均值低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),阳性药组的尿素(Urea,UREA)均值与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。QJDSP低、中、高剂量组的肌酐(Creatinine,Cr)均值与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。阳性药组的Cr均值高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。通过对NSCLC细胞A549移植瘤裸鼠的肝脏及肾脏进行HE染色,发现各组的肝、肾脏组织形态间无明显差别。4.网络药理学和转录组测序分析QJDSP治疗NSCLC潜在分子机制通过TCMSP网站最终查找到QJDSP的244个治疗靶点。检索7个数据库中的NSCLC,取至少在两个数据库中出现的靶点,共得到787个作用靶点,两者取交集后得到89个潜在治疗靶点,将这些靶点进行蛋白互做(protein protein interaction,PPI)网络分析、GO富集分析,KEGG富集分析。转录组测序共得到355个差异化表达基因,其中上调基因93个,下调基因262个,将这些基因进行PPI网络分析、GO富集分析,KEGG富集分析。将网络药理学的KEGG富集分析结果与转录组学KEGG富集分析结果取交集,共得到16条与肿瘤相关的信号通路,分别为细胞凋亡、细胞周期、p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、Fox O信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、NOD样受体信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、Toll样受体信号通路、神经营养蛋白信号通路。细胞实验发现其能够明显诱导A549和H1650细胞凋亡,前期研究表明其抗肿瘤作用可能与p53蛋白有关,故推测QJDSP抗肿瘤作用可能与p53信号通路诱导NSCLC细胞凋亡有关。通过Annexin V/PI染色实验发现A549和H1650细胞的高剂量组早期凋亡率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。高剂量组加p53抑制剂组的早期凋亡率则低于高剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05)。通过WB实验对p53凋亡信号通路上p53、bcl-2、bax、cytc、pro-caspase 3、cleaved-caspase 3蛋白表达量进行检测,发现A549细胞的高剂量组蛋白表达量与对照组相比,p53、cleaved-caspase 3、cytc、bax蛋白表达量上升,bcl-2,pro-capase3等蛋白表达量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。A549细胞的高剂量组蛋白表达量与高剂量加p53抑制剂组对比发现,cleaved-caspase 3、cytc、bax蛋白的表达量下降,bcl-2、pro-capase3蛋白的表达量上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。H1650细胞的高剂量组蛋白表达量与对照组相比,p53、cleaved-caspase 3、cytc、bax蛋白表达量上升,bcl-2,pro-capase3等蛋白表达量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。H1650细胞的高剂量组蛋白表达量与高剂量加p53抑制剂组对比发现,cleaved-caspase 3、cytc、bax蛋白的表达量下降,bcl-2、pro-capase3蛋白的表达量升上,差异具有统计学意义(P<0.05)。通过WB实验对瘤体蛋白含量进行检测,发现中剂量组、高剂量组、阳性药组瘤体蛋白表达量与对照组相比,p53、cleaved-caspase 3、cytc、bax蛋白表达量上升,bcl-2,pro-capase3等蛋白表达量下降,且差异具有统计学意义(P<0.05)。通过Q-PCR实验对瘤体中m RNA的表达量进行检测,发现中剂量组、高剂量组、阳性药组瘤体m RNA表达量与对照组相比,p53、caspase 3、cytc、bax基因的m RNA表达量上升,bcl-2基因的m RNA表达量下降,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.QJDSP联合化疗组的患者治疗后的KPS评分高于单纯化疗组。QJDSP联合化疗组的客观缓解率和疾病控制率与单纯化疗组无统计学差异。2.QJDSF溶液能够抑制NSCLC细胞A549和H1650的增殖、迁移、侵袭,对人正常肺上皮细胞beas-2b增殖的抑制作用较弱,表明其对细胞增殖的抑制作用有一定地选择性。3.QJDSF溶液能够在体外通过p53信号通路诱导NSCLC细胞A549和H1650发生凋亡。4.QJDSP溶液能够在体内通过p53信号通路抑制NSCLC细胞A549裸鼠移植瘤体积增加。