肝癌是一种具有丰富血供的实体肿瘤，其生长、侵袭、转移都与血管生成有密切关系，因此调节肿瘤血管生长就可能控制肿瘤的生长。在肿瘤由无血管期发展到血管期的过程中，血管形成受到血管形成因子和抑制因子的调节，两者平衡一旦打破就可加速血管形成。虽然目前针对肝癌治疗的研究取得了较大进展，但仍缺乏有效的治疗手段且预后较差。以肿瘤新生血管为靶点的抗血管治疗是治疗肝癌的新途经，因此寻找肿瘤血管内皮细胞的特异分子标志物和靶基因将对肝癌的诊断与靶向治疗提供新的依据。　　miRNA是一种在转录后水平调节基因表达的非编码小RNA，可以在蛋白质水平上调控下游靶基因的表达，从而在细胞通路中起到重要的调节作用，其调节基因的异常表达与癌症、心血管障碍等多种疾病有关[1]。目前对于miRNA的研究多集中在肿瘤细胞，迄今为止未见到关于人肝癌血管内皮细胞(TEC)的miRNA研究。因此本课题首次通过基因芯片检测肝癌血管内皮细胞与正常肝窦血管内皮细胞中miRNA差异表达来寻求在肝癌血管形成过程中起关键调控作用的特异miRNA[2]。　　在差异表达miRNA中选取表达降低最为明显的miR-204-3p作为指标，探讨其在肝癌血管内皮细胞生长过程中的作用机制，FN1作为miR-204-3p的靶基因之一，可能参与了miR-204-3p对TEC生长的调控。FN1是细胞外基质的重要成分，为一种具有多种功能的糖蛋白大分子，参与细胞的黏附、迁移、损伤修复等过程，在抗感染、维持微血管的完成性等方面具有重要作用，同时FN1与细胞表面整合素受体结合启动了化疗抵抗现象(CAMDR)。本研究通过慢病毒转染TEC后使miR-204-3p过表达，明显抑制了FN1蛋白的表达，证实FN1作为miR-204-3p的潜在靶基因之一，可能通过miR-204-3p/FN1信号通路起到调节肝癌血管内皮细胞生长的作用，并探讨信号通路中相关作用机制，为肝癌的抗血管基因治疗提供了新的靶点和理论基础。　　实验一 HmiOA v4Human miRNA OneArray⑩芯片检测正常肝窦血管内皮细胞与肝癌血管内皮细胞中差异表达的miRNA　　目的：基因芯片检测肝癌血管内皮细胞与正常肝窦血管内皮细胞中miRNA的差异表达，探讨差异表达miRNA在肝癌血管形成过程中的关键调控作用。　　方法：采用流式细胞术检测TEC细胞表面分子CD105、CD31表达来判断TEC细胞纯度。芯片杂交前RNA样品的质控合格后采用HmiOA v4Human miRNA OneArray(@)芯片进行基因芯片表达谱检测差异miRNA的表达。　　结果：流式检测TEC细胞表面分子CD105表达率为100％，同时CD31表达率为98.7％，排除了肝癌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的污染。差异表达的miRNA数量:对比HSEC，TEC中有6种表达增高的miRNA，9种表达降低的miRNA，两者选取的标准为:log2|Fold change|≥0.585and P＜0.05.　　结论：差异表达的15种miRNA可能参与了肝癌血管内皮细胞增殖转移过程。　　实验二 miR-204-3p在TEC细胞增值中的调控作用　　目的：选取差异表达降低最明显的miR-204-3p作为指标，通过慢病毒载体转染肝癌血管内皮细胞使miR-204-3p过表达，应用MTT、细胞凋亡检测等方法检测转染前后的肝癌血管内皮细胞生物学改变情况。　　方法：miR-204-3p过表达慢病毒载体构建、包装与滴度检测。慢病毒感染TEC细胞:实验细胞分为3组，CON组:正常TEC细胞、未感染任何病毒的细胞组;NC组:正常TEC细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组;micro-up组:正常TEC细胞、加目的基因miR-204-3p up病毒感染的细胞组。MTT法检测转染前后TEC细胞增殖;Annexin Ⅴ-APC单染法流式细胞仪检测转染前后TEC细胞凋亡。　　结果：慢病毒感染TEC后滴度判断:感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，图中所示CON组没有绿色荧光，NC组可见不含目的基因的绿色荧光，micro-up组可见含有目的基因颗粒的绿色荧光，荧光率达90％以上。MTT检测转染前后TEC细胞增殖情况:连续观察5天后发现micro-up组细胞增殖明显受到抑制，而CON组与NC组增殖未受影响，并且在第4天时micro-up组（3.61±0.29）与其他对照两组比较增殖抑制率差异最大(p＜0.01)，CON组（6.31±0.14）与NC组(6.11±0.31)比较没有明显差异(p＞0.05)。流式细胞术检测转染后各实验组细胞凋亡:转染后4天，各组细胞汇合度约为90％，CON组（1.54±0.11％）与NC组（1.61±0.25％）　　无明显差异，而micro-up组(4.09±0.16％)较之其他两组出现明显的凋亡(p＜0.01）。　　结论:miR-204-3p参与对肿瘤血管内皮细胞的调控，通过调节某些靶基因从而起到抑制肝癌血管内皮细胞增值和促进凋亡的作用。　　实验三 miR-204-3p调控TEC细胞增值的作用机制　　目的：miR-204-3p参与对TEC细胞的调控，但机制尚不清楚。我们通过权威靶基因预测软件显示纤维连接蛋白(FN1)为其靶基因之一，FN1在肿瘤细胞增殖、凋亡和转移过程中起到重要的作用。拟研究miR-204-3p/ FN1信号通路在TEC细胞增殖中的调节作用。　　方法：构建含有目的基因的野生型FN1 (FN1-WT)和突变型FN1（FN1-MUT）过表达质粒载体。通过质粒转染后luciferase检测来验证FN1为miRNA-204-3p的靶基因。Western Blot方法检测TEC细胞中FN1蛋白表达情况。　　结果：FN1-WT组荧光素酶活性（0.52±0.01）明显低于对照组FN1-MUT (0.71±0.02)，差异有统计学意义(p＜0.05)，证实miR-204-3p对FN1的表达有抑制作用，并且发挥该抑制功能是通过与FN1 3UTR区结合实现的，提示FN1是miR-204-3p的靶基因。TEC细胞经转染后FN1蛋白表达量明显减少，组间差异有统计学意义(p＜0.01)，而CON组与NC组FN1蛋白表达量无明显改变。　　结论：miR-204-3p/靶基因FN1信号通路起到抑制肝癌血管内皮细胞增值和促凋亡的作用。