近年来,支原体的耐药现象已在各地出现,很多原来敏感的抗生素,不同程度的产生耐药,久治不愈的病例屡见不鲜,尽管各地报道的结果不完全一致,但敏感率不断下降的趋势是相同的。肺炎支原体不侵入机体组织与血液,其致病首先通过顶端结构粘附在宿主细胞表面,并伸出微管插入胞内吸取营养、损伤细胞膜,继而释放出神经(外)毒素、磷酸酶、核酸酶、抗原、过氧化氢等代谢产物引起细胞的溶解、上皮细胞的肿胀与坏死,诱发机体产生的抗体也可能参与了上述病理损伤。据报道所有支原体都会代谢产生腺苷磷酸化酶。综上所述,支原体代谢产生的酶在支原体致病及分类鉴定方面起到的作用有待研究。目前,对支原体代谢酶的研究国外报道很少,国内没有正式报道。由丝状支原体山羊亚种(即PG3株)所引起的山羊传染性胸膜肺炎是山羊传染病中最为流行的疾病之一,目前这种病仍广泛发生在中亚、北非、中东等养羊聚集的国家和地区,对养羊业造成严重危害。本实验利用改良的Hartleys培养基,缩短山羊支原体的培养时间,通过对山羊支原体的培养观察,为进一步研究提供材料,同时增强对山羊支原体的认识,对腺苷磷酸化酶进行了初步研究,力求为支原体的致病机理的研究以及临床鉴定诊断治疗提供更多的理论依据。1.腺苷磷酸化酶提取时间的确定目的:确定在培养后的哪个时间段支原体代谢产生的腺苷磷酸化酶活性最高,为腺苷磷酸化酶的提取提供依据。方法:分别取PG3标准株和分离株48h培养液0.1ml接种于10ml的改良Hartleys液体培养基中,接种48管,37℃恒温培养。每隔6h取3管(2ml/管),测定OD值和pH值,同时从3管中各取2ml测酶活。结果:山羊支原体在改良后的Hartleys培养基中生长适应期为0～18h,对数生长期为18～60h,稳定期为60～72h,培养72h后进入衰亡期,在60h内pH值下降较快,从pH7.5降到6.671,培养后第60h至第96h,pH值下降缓慢,保持在pH6.671～6.510;培养48h左右,酶活性最高。结论:把培养后48h作为腺苷磷酸化酶提取时间。2.腺苷磷酸化酶的提取纯化目的:为酶的特性研究作准备的同时检测纯化方法的可行性。方法:通过离心、超声波裂解、盐析、透析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等一系列蛋白质分离纯化方法对腺苷磷酸化酶进行分离纯化,并用SDS—PAGE和总酶活、总蛋白含量、纯化倍数等参数检测纯化效果。结果:腺苷磷酸化酶粗酶液SDS—PAGE分析结果显示,腺苷磷酸化酶相对分子质量约为29.1KDa,主要以胞内可溶形式存在;纯化倍数达117,纯化所得的腺苷磷酸化酶进行SDS—PAGE分析,结果显示了一条分子量约为29.1kDa的单一条带。结论:腺苷磷酸化酶得到很好的纯化,也说明分离纯化方法是可行的。3.腺苷磷酸化酶酶学特性的研究目的:了解腺苷磷酸化酶酶学特性,为更深入的研究提供理论依据。方法:配制pH分别为6.0、6.5、6.8、7.0、7.3、7.5和8.0的磷酸钾缓沖液,测定不同pH时的酶活;测定反应温度分别为30、34、37、40、45、50、55、60、65和70℃时的酶活;以腺苷、肌苷和尿苷为底物,研究腺苷磷酸化酶对不同底物的催化活性,反应体系中各底物的浓度均为1.5 mmol/l。结果:腺苷磷酸化酶有较好的热稳定性,37℃左右酶活力变化不大,最适反应温度为50℃,当温度高于55℃时,酶活力迅速下降;酶活的最适pH值为7.0,在碱性条件下,腺苷磷酸化酶的活力下降不大,但在酸性条件下,酶活下降很快,pH6.0时,酶活只有最适pH时的一半左右;腺苷磷酸化酶对腺苷显示了最大的催化活性,而肌苷是非常差的底物,对肌苷的酶比活是腺苷的5.6%,对尿苷几乎没有催化活性。结论:由培养液pH值变化测定知培养48h时的培养液pH值在7.0附近,而酶活的最适pH值为7.0,这证明把培养后48h作为腺苷磷酸化酶提取时间是正确的。4.腺苷磷酸化酶酶谱分析目的:检测此腺苷磷酸化酶是由几种亚基构成,有无同工酶存在。方法:对腺苷磷酸化酶粗酶液进行SDS—PAGE(在分离胶中加入0.1%的腺苷),电泳后,用25%的异丙醇使酶复性,复性后40℃保温反应过夜,经1%刚果红染色,1 mol/L NaCl漂洗脱色;Native-PAGE,电泳后的凝胶放入0.1%腺苷溶液中反应,40℃保温反应过夜,经1%刚果红染色,1 mol/L NaCl漂洗脱色,结果:在酶作用的相应位置就显现出透明带。结论:该菌只产生一种分子量约为29.1KDa的腺苷磷酸化酶,且该腺苷磷酸化酶是一单亚基蛋白,无同工酶存在。