柑橘细菌性和病毒类病害对柑橘产业造成了巨大的冲击,本课题通过分析柑橘细菌性和病毒类病害分子检测技术,对‘伏令夏橙’愈伤组织和柑橘植株进行了主要病害分子检测;同时对从柑橘基因组中鉴定的11个WOX转录因子家族系统发育树、基因结构、保守基序、基因共线性和表达等进行了分析;制备了柑橘Cs H4-1、Cs H4-2、Cs WUS、Cs SAM、HLB、CTV、CYVCV探针,并进行柑橘茎尖原位杂交试验,以期切取适宜大小的茎尖分生组织用于柑橘茎尖微芽嫁接。1、柑橘主要病害分子检测分析将‘伏令夏橙’愈伤组织进行黄龙病q PCR和常规PCR检测,及其衰退病、黄脉病、碎叶病、叶斑驳病、鳞皮病RT-q PCR检测,结果显示在q PCR检测中黄龙病引物A04F/A04R、HLBas/HLBr对应目标基因CT值在27.84-33.77,通过常规PCR检测发现黄龙病引物A04F/A04R存在非特异性扩增;同时在RT-q PCR检测中衰退病等目标基因CT值在30.35-33.37,也进一步验证了愈伤组织带毒量极低甚至无毒的特性,可作为柑橘病害分子检测的阴性对照。同时对‘甜柚’、‘桔柚’、‘晚棱’、‘茂柑’、‘日南’、‘寻乌’总共66株柑橘的叶片进行衰退病RT-q PCR检测和黄脉病巢式RT-PCR检测,其中感染衰退病有20株,感染黄脉病有59株,复合感染有20株。2、柑橘WOX转录因子家族分析从柑橘基因组中鉴定出11个WOX转录因子家族成员,均含有的同源异型结构域与保守基序motif-1相对应,同时现代进化支成员包含WUS-box结构域,与保守基序motif-3相对应。并且发现柑橘和拟南芥WOX直系同源基因的基因结构高度保守,并存在共线性关系,进一步说明两者系统发育树结果的可靠性。同时柑橘WOX转录因子家族启动子包含了大量TATA-box、CAAT-box顺式作用元件,还有ABRE、MYB等胁迫相关的顺式作用元件。此外对柑橘WOX转录因子家族的表达进行初步分析,CTV、CYVCV、Cs SAM在‘寻乌’茎尖表达量高,Cs WUS在茎尖表达量低;Cs WOX3在‘甜柚’茎尖、叶、刺、花瓣、雄蕊、雌蕊表达量高,说明Cs WOX3参与叶片和花器官的发育。3、柑橘茎尖原位杂交和微芽嫁接分析通过对柑橘黄龙病、衰退病和黄脉病病原多序列分析和构建柑橘Cs H4-1、Cs H4-2、Cs WUS、Cs SAM基因载体,以重组质粒扩增的探针目的片段为模板进行体外转录获得了柑橘Cs H4-1、Cs H4-2、Cs WUS、Cs SAM、HLB、CTV、CYVCV探针,并进行柑橘茎尖原位杂交试验。结果发现,组蛋白Cs H4-1、Cs H4-2在柑橘组织表达量高,用于检验原位杂交实验方法的可行性,但未检测到杂交信号,Cs WUS、Cs SAM、CTV、CYVCV探针也未检测到杂交信号;基于16S r DNA序列设计黄龙病原位杂交探针,HLB-2探针的特异性不强,原位杂交结果可能为背景或假信号,HLB-1探针的特异性较强,原位杂交结果也可能为背景或假信号,还需要经过反复验证。通过体视显微镜和扫描电镜腔观察柑橘‘甜柚’含有2-3个叶原基和生长点的茎尖,大小在0.18～0.25 mm左右;切取含有2-5个左右的叶原基和生长点的茎尖嫁接到枳黄化砧木切口上,将嫁接苗定植于MS液体培养基培养,第二周时将暂时成活的嫁接苗移栽至基质中,之后成活苗有:‘甜柚’4株,‘桔柚’15株,‘晚棱’7株,‘茂柑’11株,‘日南’2株,‘寻乌’1株。