论文部分内容阅读
我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中克隆到一个家蚕新基因。该基因序列全长819bp,其ORF框编码272个氨基酸残基,预测蛋白相对分子质量为28.44kD,等电点为4.1,为酸性蛋白质。在NCBI数据库中对此序列进行比对分析,发现此序列和鳞翅目的罗奴霉素毛虫(Lonomia obliqua caterpillars)中的假定蛋白29有57％的相似性。故我们将该基因命名为Bm29,GenBankNO.DQ985599。通过PCR方法克隆的目的片段经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到pET-28a(+)载体上构建重组质粒pET-28a(+)-Bm29,将重组子转化大肠杆菌Rosetta,将筛选的阳性克隆菌用终浓度为1.4mmol/L的IPTG诱导,裂解菌体后进行SDS-PAGE分析,在32kD左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值(融合标签3.56kD,Bm2928.44kD)相符。超声裂解菌体后,发现融合蛋白His-Bm29以可溶性形式存在。先采用阴离子交换层析纯化目的蛋白,然后通过镍柱亲和层析进一步纯化。将纯化后的蛋白His-Bm29免疫新西兰兔,制备该融合蛋白的多克隆抗体。ELISA检测该抗体血清的效价达到1:12800。Western blotting分析结果表明其具有较高的特异性。
提取家蚕各发育时期以及五龄幼虫的各组织中的总RNA和总蛋白,利用荧光定量PCR和Western blotting实验检测Bm29在五龄幼虫不同组织和四个发育时期的转录和表达水平。实验结果表明,Bm29基因在不同组织和不同发育阶段的转录和表达水平存在较大的差异。荧光定量PCR结果显示:家蚕各发育时期中蛹中Bin29的mRNA含量最高,家蚕各五龄幼虫组织中马氏管、卵巢和头中最高,脂肪体最低。Western blotting结果表明:家蚕不同发育时期,蛹中Bin29蛋白表达量最高,五龄幼虫各组织中,马氏管、头以及丝腺蛋白表达量较高,中肠和脂肪体含量最低。以家蚕BmN细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,Bin29蛋白主要分布在细胞质和细胞膜周围。以上的研究结果为深入研究家蚕新基因Bin29的功能奠定了基础。