论文部分内容阅读
研究背景心肌梗死（MI）是导致心力衰竭（HF）最常见的原因。以成纤维细胞活化和心肌纤维化为特点的心肌重构是心衰发展过程中的重要环节。然而，导致心梗后心衰发展过程中成纤维细胞活化和心肌纤维化的具体机制目前尚不完全清楚。1-磷酸鞘氨醇（S1P）是鞘脂类物质的代谢产物，具有抗凋亡、促炎、诱导纤维化等多种生物作用，参与调控全身多种病理生理过程。机体中存在多种调控S1P水平的合成酶和降解酶类。鞘氨醇激酶（SphK1）是调控心肌S1P生成的关键酶，S1P裂解酶（SPL）是催化S1P降解的唯一不可逆性酶类，两者均是细胞内调控S1P水平的关键酶。本课题组前期研究发现，S1P可通过抑制心肌细胞凋亡减轻心肌缺血/再灌注损伤。然而，越来越多的实验研究发现，局部S1P水平增高可导致多个组织/器官发生炎症反应和纤维化。那么，MI后心肌组织中是否存在S1P水平增高？S1P是否促进心肌纤维化和心衰进展？目前均不完全清楚。研究发现SphK1过表达小鼠出现心肌肥厚和心肌纤维化等心肌重构表现。然而，SPL在MI后病理性心肌重构中的作用却尚未见报道。实验目的（1） MI后心肌组织中SphK1和S1P的变化（2）通过抑制SPL活性增加S1P水平，观察S1P对MI后心肌重构的作用和机制实验方法（1）12只成年雄性C57BL/6J小鼠（25~30g，第四军医大学动物中心提供）行左冠状动脉前降支结扎术，建立心肌梗死（MI, n=6）模型或假手术（Sham,n=6）模型；（2） MI后4周，采用western blot检测心肌组织中SphK1的蛋白水平；（3）采用ELISA试剂盒，分别检测MI和Sham组小鼠手术4周后血清和心肌组织中的S1P水平；（4）分离培养乳鼠心脏成纤维细胞，分别采用0、0.1、1.0和10umol/L的S1P处理24小时，采用western blot和实时定量PCR分别检测成纤维细胞TGF-β的蛋白和mRNA表达；（5）采用SPL的siRNA转染乳鼠心脏成纤维细胞，48小时后采用western blot检测SPL蛋白表达，再检测S1P处理对细胞TGF-β蛋白表达的影响；（6）60只成年雄性C57/BL6J小鼠随机分为以下4组：假手术组（Sham, n=10）、心肌梗死组（MI, n=20）、假手术+THI组（Sham+THI, n=10）和心肌梗死+THI组（MI+THI, n=20）。其中，THI是SPL的特异性抑制剂，以25mg/L溶于饮水中，于MI或sham术后24h首次饲喂小鼠，2次/天，饲喂2周；（7） MI4周后，采用ELISA试剂盒检测心肌组织中S1P含量；（与3重复）（8） MI4周后，采用western blot检测TGF-β蛋白表达；（9） MI4周后，采用实时定量PCR检测心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的mRNA表达；（10） MI4周后，采用小动物心脏超声仪评估小鼠心脏结构和心脏功能变化；（11） MI4周后，根据HW/BW评价心肌肥厚；（12） MI4周后，采用masson-trichrome染色检测心肌纤维化；（13） MI4周后，采用实时定量PCR检测心肌组织中ANP、BNP和α-SMA的mRNA表达。实验结果（1）与Sham组相比，小鼠MI4周后心肌组织中SphK1蛋白表达显著升高（P<0.05）；（2）与Sham组相比，小鼠MI4周后血清S1P浓度无显著改变，但心肌组织中S1P水平明显增高（P<0.05）；（3）在分离培养的乳鼠心脏成纤维细胞中，S1P剂量依赖性增加TGF-β的蛋白和mRNA表达，1.0μmol/L的S1P即可显著增加TGF-β的蛋白和mRNA表达（均P<0.05）；（4） SPL的siRNA转染后48小时，乳鼠心脏成纤维细胞中SPL显著下降（P<0.05）；SPL的siRNA显著增加S1P对成纤维细胞TGF-β蛋白表达的上调作用（P<0.05）；（5）手术4周后，与Sham组相比，Sham+THI组小鼠心肌组织中S1P的水平显著增加（P<0.05）；与Sham组相比，MI组小鼠心肌组织中S1P的水平显著增加（P<0.05）；与MI组相比，MI+THI组小鼠心肌组织中S1P的水平显著增加（P<0.05）；（6）手术4周后，western blot结果显示：与Sham组相比，Sham+THI组小鼠心肌组织中TGF-β蛋白表达显著增加（P<0.05）；与Sham组相比，MI组小鼠心肌组织中TGF-β蛋白表达显著增加（P<0.05）；与MI组相比，MI+THI组小鼠心肌组织中TGF-β蛋白表达显著增加（P<0.05）；（7）手术4周后，实时定量PCR结果显示：与Sham组相比，Sham+THI组小鼠心肌组织中Col1a1，Col3a1的mRNA表达显著增加（两者P<0.05）；与Sham组相比，MI组小鼠心肌组织中Col1a1，Col1a3，Col3a1的mRNA表达显著增加（均P<0.05）；与MI组相比，MI+THI组小鼠心肌组织中Col1a1，Col1a3，Col3a1的mRNA表达显著增加（均P<0.05）；（8）手术4周后，小动物超声心动图结果显示：与Sham组相比，Sham+THI组小鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室收缩末期内径（LVESD）和舒张末期内径（LVEDD）均无显著变化；与Sham组相比，MI组小鼠LVEF显著降低（P<0.05）、LVESD和LVEDD均显著增大（均P<0.05）；与MI组相比，MI+THI组小鼠射血分数进一步降低（P<0.05）、LVESD和LVEDD均进一步增大（均P<0.05）；（9）手术4周后，与Sham组相比，Sham+THI组小鼠HW/BW比值无明显改变；与Sham组相比，MI组小鼠HW/BW比值显著增大（P<0.05）；与MI组相比，MI+THI组小鼠HW/BW比值进一步增大（P<0.05）；（10）手术4周后，masson-trichrome染色结果显示：与Sham组相比，Sham+THI组小鼠心肌纤维化程度无明显改变；与Sham组相比，MI组小鼠心肌纤维化程度明显加重；与MI组相比，MI+THI组小鼠心肌纤维化程度进一步加重；（11）手术4周后，实时定量PCR结果显示：与Sham组相比，Sham+THI组小鼠心肌组织中的ANP，BNP和α-SMA的mRNA表达无显著改变；与Sham组相比，MI组小鼠心肌组织中ANP，BNP和α-SMA的mRNA表达显著增加（均P<0.05）；与MI组相比，MI+THI组小鼠心肌组织中ANP，BNP和α-SMA的mRNA表达显著增加（均P<0.05）。结论通过在体动物实验和体外细胞实验，本研究发现：（1）心肌梗死后心肌中S1P信号上调；（2） S1P上调TGF-β信号促进心肌纤维化；（3）抑制SPL活性上调S1P信号加重MI后心肌重构和心功能紊乱。