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糖尿病是一种复杂的代谢综合征,在很大程度上增加微血管和神经病变的风险。II型糖尿病,又称非胰岛素依赖型糖尿病和成年型糖尿病,约占全部糖尿病患者的85%～90%,其特征表现为患者对胰岛素给药不敏感,而胰岛素受体（Insulin receptor,IR）介导的细胞信号传导障碍可能是胰岛素耐受的主要原因。胰岛素信号转导通路错综复杂,其中最主要的包括胰岛素受体底物下游的PI3K/ATK通路、MAPK/ERK通路和CAP/Cbl/Tc10途径。葡萄糖代谢可能受到胰岛素受体细胞信号传导通路和肾上腺素受体信号通路的协同调节。研究表明IR和β2肾上腺素受体（β2 adrenergic receptor,β2AR）之间可能存在相互作用,本研究采用转录组学、细胞生物学、生物化学与分子生物学以及Western blot、ELISA和高效液相色谱（HPLC）、CRISPR/Cas9介导的基因编辑等技术手段分析IR与β2AR的相互作用结构域及作用方式以及β2AR对胰岛素受体下游细胞信号传导的影响,对于了解胰岛素耐受的分子机理以及寻找治疗胰岛素耐受的药物作用靶点提供有价值的参考,实验过程与结果如下所述。1.转录组测序分析筛选胰岛素信号传导途径关键基因在实验中,分别用β1AR抑制剂:CGP 20712 dihydrochloride(10-6 M)、β2AR抑制剂ICI118551(10-6 M)、PKA抑制剂myristoylated PKI(10-5 M)、MEK抑制剂PD0325901(2×10-7 M)、JNK抑制剂SP600125(2×10-7 M)对H9C2细胞进行预处理后,再用异丙肾上腺素（ISO）和胰岛素刺激细胞,收集样品进行转录组测序分析。实验结果表明每个样品的clean data在5.7 G～12.2 G之间,并且95.7%以上的reads定位在参考基因组上。不同样品组间差异表达基因总数在43～4461之间,对差异表达基因（DEG）进行GO分析,发现在分子功能（Molecular Function,MF）中与催化活性（catalytic activity）及结合（binding）等有关的DEG较多。在生物过程（Biological Proccess,BP）中,参与代谢过程（metabolic process）及细胞过程（cellular process）等的DEG较多。在细胞组分（Cellular Component,CC）中,与细胞（cell）及细胞组成部分（cell part）等有关的DEG较多。KEGG pathway分析发现DEG主要集中在PI3K-Akt、MAPK和胰岛素等细胞信号传导通路。Venn分析显示PI3K-AKT、MAPK和胰岛素等信号通路等包含有相同的DEG。对所有DEG进行加权基因共表达网络分析,得到其中胰岛素信号传导途径中的关键基因互作网络图。2.Q-PCR分析胰岛素信号传导途径互作网络中的关键基因表达在上述生物信息学分析基础上,利用Q-PCR对IR、IRS1、β2AR和GAB1以及关键下游基因PPAR alpha、Tc10、Fox O1和Glut4进行定量分析验证。结果显示胰岛素刺激Glut4基因表达,使用ISO预处理后抑制Glut4基因表达,而ICI预处理可以缓解ISO对胰岛素信号传导的影响,说明其通过β2AR受体发挥功能。使用PKI、PD0325901、SP600125预处理均可缓解ISO对胰岛素信号传导的影响,其中PKI预处理的效果最明显,说明该抑制作用通过PKA通路发挥作用,同时MEK/ERK信号通路也参与其中。胰岛素诱导Fox O1基因表达水平下调,而加入ISO显著上调Fox O1基因表达;使用ICI、CGP、SP600125、PKI和PD 0325901预处理阻碍ISO上调Fox O1基因表达的作用。胰岛素诱导Tc10基因表达水平上调,而加入ISO可以抑制胰岛素诱导的Tc10上调。另外,胰岛素诱导PPAR基因表达水平下调,而加入ISO则显著上调PPAR基因表达。以上实验结果表明,ISO通过β2AR-PKA和MEK/ERK信号通路抑制胰岛素信号传导,并且Fox O1、Tc10和PPAR基因介导Glut4基因表达调控参与其中。研究还发现,IR、IRS1、β2AR和GAB1表达水平没有显著变化。Q-PCR实验结果与RNA-Seq分析结果基本一致。3.酵母双杂交（Yeast two-hybrid,Y2H）、免疫共沉淀（Co-IP）以及标签pull-down实验分析IR-β2AR蛋白质复合物组成Y2H实验分析结果表明β2AR可以分别与IRS1以及GAB1相互作用。通过构建的序列缺失载体进行的互作实验表明,β2AR的230-310位氨基酸残基（AA）序列对于β2AR与GAB1蛋白相互作用发挥关键作用,是介导蛋白质相互作用的序列片段。Co-IP实验结果表明,β2AR可以分别与IR、IRS1、GAB1免疫共沉淀。为进一步验证这些蛋白质间的相互作用,构建了pc DNA3.1-His-GAB1、pc DNA3.1-His-IR和pc DNA3.1-His-β2AR融合表达载体,并转染细胞。然后,进行标签pull-down实验,结果表明β2AR与IR、β2AR与GAB1、Grb2与IR、Grb2与GAB1蛋白可以形成蛋白质复合物。综合Y2H、Co-IP以及标签pull-down结果表明:β2AR、Grb2、GAB1、IRS1以及IR可以形成蛋白复合物。4.持续刺激β2AR抑制胰岛素作用的细胞信号传导途径分析利用上述抑制剂对细胞分别进行处理后,用HPLC检测细胞内c AMP水平变化。结果表明激活β2AR对胰岛素信号传导的抑制作用是通过c AMP-PKA通路发挥的。JNK（Thr-183/Thr-185）磷酸化水平检测表明,ISO刺激p JNK磷酸化水平增强,而上述抑制剂预处理可以降低ISO刺激p JNK磷酸化水平增强的作用,表明JNK介导的细胞信号传导通路也参与了β2AR激活对胰岛素受体下游细胞信号传导的抑制作用。5.持续刺激β2AR对胰岛素诱导的Glut4蛋白表达和葡萄糖摄取的影响采用与上述类似的方法处理野生细胞组以及β2AR敲除细胞组后,利用ELISA法检测Glut4蛋白表达并分析细胞对葡萄糖的摄取,结果显示野生型细胞组中胰岛素诱导Glut4蛋白表达并促进细胞对葡萄糖的摄取;而ISO预处理可以抑制胰岛素的作用,用ICI118551、PKI和SP600125分别预处理细胞可以减弱ISO对胰岛素的抑制作用。β2AR敲除细胞组中ISO预处理对胰岛素信号的抑制作用消失,表明β2AR受体激活后通过PKA以及MEK信号传导途径发挥作用。本研究阐明了持续性刺激β2AR抑制胰岛素作用的分子机理,包括β2AR与IR等蛋白质复合物的形成以及相关的细胞信号传导过程。对于了解胰岛素耐受的形成机理以及寻找治疗胰岛素耐受的药物作用靶点有重要的理论意义和实际价值。