【摘 要】
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芋螺这一物种的毒液包含十分丰富且独特的生物活性多肽,这些多肽被称作为芋螺毒素,大多数芋螺毒素可以作用于特定的受体或离子通道,拥有巨大的新药开发潜力。但因海洋生态环境的破坏和无序采集,芋螺的种类和数量在不断减少,在国际上已被列为濒危保护动物。所以,对芋螺遗传资源和基因信息的长期保存具有非常重要的科学和实际意义。每个芋螺个体都包含数千种芋螺毒素,然而已报道的芋螺毒素不足总量的1%,已经鉴定药理学性质的
【基金项目】
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国家自然科学基金:No.41966003； 国家自然科学基金:No.81872794；
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芋螺这一物种的毒液包含十分丰富且独特的生物活性多肽,这些多肽被称作为芋螺毒素,大多数芋螺毒素可以作用于特定的受体或离子通道,拥有巨大的新药开发潜力。但因海洋生态环境的破坏和无序采集,芋螺的种类和数量在不断减少,在国际上已被列为濒危保护动物。所以,对芋螺遗传资源和基因信息的长期保存具有非常重要的科学和实际意义。每个芋螺个体都包含数千种芋螺毒素,然而已报道的芋螺毒素不足总量的1%,已经鉴定药理学性质的芋螺毒素则更少,仍有很大一部分芋螺毒素尚待发现和鉴定。目前对于芋螺毒素基因多样性的研究工作并不全面,也还有待于进一步的研究。Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过抑制丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等）的活性,以影响蛋白质和多肽的代谢。芋螺可将含上千种芋螺毒素多肽的毒液注射进入猎物体内而发挥作用,其中很有可能携带着多种蛋白酶抑制剂类的毒素而抑制猎物体内蛋白酶的活性,从而避免自身芋螺毒素多肽的降解和失效。然而目前在芋螺毒液中尚未发现有活性的Kunitz型蛋白酶抑制剂。本文主要围绕芋螺基因资源的长期保存与利用,信号芋螺中芋螺毒素及其基因的多样性,信号芋螺中Kunitz新型蛋白酶抑制剂的发现与活性鉴定三个问题进行了研究和讨论。一、研究首先针对中国南海产大理石芋螺（Conus marmoreus）,利用磁珠法提取其高质量的基因组DNA,经过末端修复和胶回收、连接、包装、侵染等步骤,构建大理石芋螺基因组Fosmid文库。经鉴定该文库包括242 500个克隆;克隆片段长度平均约为40 kb;文库覆盖了大理石芋螺基因组的4.61倍。经过传代培养,第0代和第100代的Fosmid克隆的质粒酶切图谱无明显差异。该基因组Fosmid文库对基因组的覆盖率高,稳定性好。本文还利用该文库克隆出了1个新的α-芋螺毒素前体基因。大理石芋螺Fosmid文库的构建有利于该种芋螺的基因组资源长期保存而不会因物种濒危被丢失,将为大理石芋螺毒素基因的进一步发掘、基因序列结构和功能的研究等奠定重要基础。二、本文还综合运用了高通量测序技术、传统的测序技术和生物信息学方法,分析了来自中国南海的一种食虫芋螺信号芋螺（C.litteratus）中的芋螺毒素及其基因的多样性。最终从芋螺的毒管中推测出了128个芋螺毒素序列,其中的大部分可以分类到22个已知的超家族中,其中M-超家族是已知的超家族中种类最丰富的毒素,其中还包括43个新超家族的毒素。这些芋螺毒素中,有15种已知的半胱氨酸框架,比例最大的半胱氨酸框架为VI/VII（CC-CC-CC）,IX（CCC-CCC）和XIV（C-C-C-C）,还发现了5种全新的半胱氨酸骨架。此外,信号芋螺毒管转录组中微卫星序列的检测和分析结果表明,二元核苷酸是最主要的重复类型。信号芋螺中芋螺毒素密码子使用偏好性的研究结果表明,芋螺毒素基因整体密码子偏好性比较弱,但M-、O1-和O2-超家族的密码子使用偏好性却彼此不同。根据预测的芋螺毒素我们还进行了基因克隆,首次报道了B1-、J和F超家族的结构,B1-和J-超家族的芋螺毒素的基因并不包括内含子,F-超家族的成熟肽区域包含一个长度为1273-1339 bp的内含子,这与之前报道的其他超家族的基因结构截然不同。这项研究将增进我们对芋螺毒素及其基因多样性方面的理解,进一步奠定芋螺毒素在分子生物学方面的研究基础,而且这些新发现的芋螺毒素可以为药理学探针和海洋多肽药物的开发提供更多潜在的候选药物和模板。三、本文同时从信号芋螺的毒液中发现了7种不同的Kunitz新型的毒素多肽,与传统的BPTI类毒素有一定的同源性。其中我们对Lt069及其突变体Lt069v和Lt098进行了克隆表达和活性测试。结果发现,Lt069可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性,Lt069是第一个在芋螺毒液中鉴定的Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂,虽然它对于胰蛋白酶活性的抑制不如BPTI,但对胰凝乳蛋白酶活性的抑制比BPTI强。这证明了芋螺的毒管毒液中存在蛋白酶抑制剂类的毒素。另外,Lt069、Lt098v、BPTI三者的结构高度相似。将Lt069序列的P1位点的氨基酸由苯丙氨酸突变成精氨酸之后,Lt069v对胰蛋白酶的活性的抑制有一定程度的增强。Lt098v可以抑制胰蛋白酶的活性,但对胰凝乳蛋白酶的活性没有抑制作用。这是关于芋螺毒液中的Kunitz型蛋白酶抑制剂抑制活性的首次报道,有助于我们进一步了解芋螺毒素的多样性。综上所述,本文构建了大理石芋螺Fosmid基因组文库,系统地研究了信号芋螺中毒液肽与其基因的多样性,发现并研究了其中的新型Kunitz蛋白酶抑制剂,这些研究为芋螺基因资源的长期保存、芋螺毒素及其基因多样性和芋螺多肽类药物的研究、芋螺中新型Kunitz蛋白酶抑制剂的研究与利用奠定了基础。
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