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牙周炎是一种累及牙周支持组织的慢性炎症性疾病,是导致成年人牙齿松动脱落的罪魁祸首。目前牙周炎的常规治疗方法有牙周洁治、刮治等基础治疗和牙周翻瓣术、根面平整术等牙周手术治疗,以及联合光动力治疗等方法,这些治疗能够阻断牙周炎症情况的进展,但对于已经缺损的牙周支持组织,尤其是缺损牙槽骨的再生,其效果仍不可观。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是从牙周膜中分离而得的间充质来源干细胞,具有较强的自我增殖与多向分化能力,成为组织再生工程的种子细胞。因此,针对牙周膜干细胞的成骨分化能力的机制及应用研究十分重要。本课题组前期在模拟高原低氧牙周炎条件下培养人牙周膜干细胞,通过基因芯片技术筛选出该环境下差异表达基因NOG。当前针对Noggin的研究多涉及神经系统,而Noggin同时可特异性抑制BMP(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路,从而在骨、软骨以及关节等的形成当中发挥重要作用。此外,Noggin在牙齿形态发生、牙周组织改建等方面也有重要作用。因此,本实验拟探讨Noggin对人PDLSCs成骨分化的影响及有关分子机制,为将PDLSCs应用于组织工程学,从而修复牙周炎缺损提供理论依据。方法:1.牙周膜干细胞的分离、培养与鉴定:采用组织块法结合酶消化法,从人牙周膜中分离培养牙周膜细胞,并通过有限稀释法检测克隆形成能力并分离牙周膜干细胞、检测成骨、成脂、成软骨三向分化能力、流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物。2.收集炎性牙周组织及健康牙周组织(组织分别来源于因重度牙周炎而拔除的患牙及因正畸减数治疗拔除的健康牙齿),quantitative polymerase chain reaction(qPCR)及Western blot检测Noggin基因与蛋白在炎性牙周组织中的表达,以及成骨相关基因alkaline phosphatase(ALP)、collagen type 1(COL1)、osteocalcin(OCN)及runt-related transcription factor 2(RUNX2)在炎性牙周组织中的表达。3.通过Western blot、细胞免疫荧光等方法,检测Noggin蛋白在人PDLSCs中的表达,以及革兰氏阴性牙龈卟啉单胞菌毒力因子(lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,LPS-PG)刺激人PDLSCs模拟牙周炎条件下Noggin蛋白在人PDLSCs中的表达。4.以外源性重组Noggin蛋白刺激人PDLSCs,检测人PDLSCs成骨分化矿化能力、成骨相关因子ALP、COL1、OCN及RUNX2的基因与蛋白表达,检测Noggin对人PDLSC成骨分化的影响。5.用siRNA NOG转染人PDLSCs,收集蛋白后Western blot检测BMP2的表达;外源性重组Noggin蛋白刺激人PDLSCs后,收集蛋白后Western blot检测RUNX2的表达。结果:1.实验所分离人牙周膜细胞能够形成细胞克隆,具有体外成骨成脂成软骨三向分化的能力,阳性表达CD29、CD44等间充质干细胞表面标志物,阴性表达CD34、CD45等造血干细胞表面标志物。2.炎性牙周组织中成骨相关基因和蛋白ALP、COL1、OCN及RUNX2表达降低,Noggin的基因与蛋白表达增加。3.Noggin蛋白在人PDLSCs中表达,且经LPS-PG刺激人PDLSCs模拟牙周炎炎症后Noggin蛋白表达增加。4.外源性重组Noggin蛋白能够干扰人PDLSCs成骨分化,导致矿化结节减少、茜素红染色减弱,成骨相关因子ALP、COL1、OCN及RUNX2的基因及蛋白表达水平降低。5.将siRNA NOG转染人PDLSCs,Western blot检测BMP2表达降低;外源性重组Noggin蛋白刺激人PDLSCs后,Western blot检测RUNX2的表达降低。结论:1.本实验首次发现炎性牙周组织中Noggin的基因与蛋白表达高于健康牙周组织,提示Noggin可能与牙周炎病程相关。2.本实验发现Noggin可以减少PDLSCs成骨分化过程中成骨相关因子ALP、COL1、OCN及RUNX2的mRNA和蛋白表达,以及钙化结节的形成。3.本实验结果提示,Noggin可能有助于BMPs的稳定表达,同时Noggin可能通过干扰BMP信号通路的信号传递,抑制RUNX2的表达,从而干扰人PDLSCs的成骨分化。