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对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)和传染性皮下及造血组织坏死性病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是对虾养殖业中最常见的两种主要病原微生物,可分别引起对虾白斑综合征和慢性矮小短缺综合症(DRS)。这两种病毒具有毒力强、复制快、传播范围广、致死率高等特点。自上世纪八十年代以来,这两种病毒性疾病的爆发,给全球对虾养殖业造成了严重的经济损失。目前,对这两种病毒性疾病的防治和控制还尚无有效药物,唯一阻止其快速爆发的有效方法,就是在对虾养殖过程中实施早期诊断和提前预防的策略。针对上述现状,本文以WSSV和IHHNV两种病毒为研究对象,旨在开发一套基于重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测WSSV和IHHNV的诊断方法。同时,从稳定性、重复性、灵敏度和检测时间等方面对该方法进行系统分析,证实了其具有等温、快速、便携等特点,给对虾样品WSSV和IHHNV等病原微生物的原位检测提供了技术支撑。本文研究结果主要包括:(1)建立了一套针对对虾样品WSSV病毒的实时、快速、等温检测方法。首先针对含有WSSV保守DNA片段(VP28)的重组质粒标准品,建立一套RPA-WSSV标准检测方法;然后采集不同养殖季节的对虾样本,提取其肝胰腺和肌肉组织的总DNA;利用RPA-WSSV方法对虾体中WSSV基因组进行检测,同时与q PCR(Mendoza-Cano F等人构建)检测结果进行比较。结果显示,RPA-WSSV方法在7min内39℃条件下,可以快速检测出虾体中WSSV病毒DNA,其灵敏度达到10个分子,表明WSSV-RPA检测体系是一个灵敏度高、特异性强和可靠性好的分子诊断方法。(2)建立了一套针对对虾样品IHHNV病毒实时、快速、等温的检测方法。首先针对含有IHHNV基因组保守DNA片段的重组质粒标准品,建立一套RPA-WSSV标准检测方法;同样采集不同养殖季节的对虾样本,提取其肝胰腺和肌肉组织的总DNA;利用RPA-IHHNV方法对虾体中IHHNV基因组进行检测,同时以OIE公布的标准q PCR检测方法作为对照。结果显示RPA-IHHNV方法同样可以在39℃条件下,7分钟以内,对虾体中IHHNV病毒DNA进行快速检测,其灵敏度达到4个分子,进一步表明WSSV-IHHNV检测体系是一个灵敏度高、特异性强和可靠性好的分子诊断方法。(3)RPA引物和探针的设计是目前该方法成功的关键和瓶颈。本研究通过设计多组RPA引物和探针,结合引物优化和筛选实验,较为系统地分析了RPA引物和探针的设计原则和相关机制。具体包括:在5’端3-5个碱基处,最好是嘧啶碱基(T/C),不要出现G,嘧啶碱基利于引物与重组酶形成引物-重组酶复合体,提高扩增效率;3’端最好是碱基G或者C,这样引物与模板之间结合更加稳定;结合同一条模板的引物与探针之间应相差少量碱基,不能相隔太多碱基,也不能有重叠。总之,本研究应用RPA技术成功构建了RPA-WSSV和RPA-IHHNV快速检测体系,随后对RPA方法进行深入分析并首次系统提出RPA引物设计基本原则,为实现对虾样品中WSSV和IHHNV病毒的原位检测提供了一定的技术支持,具有良好的应用前景。