背景乳腺癌已位居女性恶性肿瘤发病率之首,严重威胁着人类的健康。据统计,2008年,全球大约有138万人新诊断为乳腺癌,占全球肿瘤新发病数的23%,仅次于肺癌,在所有肿瘤发病率中排名第二。近20年来,我国乳腺癌的发病率呈现不断上升的趋势,京津沪等大城市尤为明显。与欧美等西方国家相比,我国乳腺癌患者发病年龄较小,30岁即呈现发病率上升,发病高峰年龄在40-49岁,比西方国家早10-15年,对人群和社会的危害更大。虽然乳腺癌的诊断和治疗水平在过去三十年取得了明显的进步,术后5年、10年生存率有了明显的提高,但伴有远处转移的患者临床预后仍然较差,乳腺癌难以彻底根治和致死主要原因是肿瘤的远处转移,90%的乳腺癌患者死亡是癌症转移所导致的。乳腺癌的发生、侵袭、转移是一个复杂的、多因素调控的、多个转移相关蛋白相互作用的动态过程,目前对乳腺癌转移的相关研究很多,但转移的作用机理仍然不是很明确。对乳腺癌相关基因和基因编码的蛋白及转移机制的的研究,有利于抑制乳腺癌的转移,降低乳腺癌发病率和死亡率,提高乳腺癌病人的生存质量。深入了解乳腺癌转移的分子机制将有助于发现和治疗乳腺癌,这对于提高乳腺癌患者生存率有着十分重要的意义。Ca2+作为一类广泛存在的第二信使,参与了肿瘤发生、侵袭、转移等一系列过程,钙离子在维持机体内稳态和机体功能有重要作用。细胞的正常生长需要维持细胞内环境的稳定,细胞增殖依赖于细胞外Ca2+的流入以及细胞内ER钙池的含量。细胞膜上主要有5种钙离子通透性通道在不同的细胞上存在并介导Ca2+进入细胞内而产生多种刺激,包括：电压门控钙通道、配体门控通道、瞬时感受器电位、钙库调控的钙通道和花生四烯酸调控的钙通道。钙库调控的钙通道(SOCs)是肿瘤细胞的主要Ca2+内流通道。钙库调节钙内流(store-operated calcium entry),即SOCE,指的是内质网的Ca2+浓度下降激活细胞膜上SOC通道而引起的细胞外Ca2+内流的过程。SOCE是非兴奋细胞,例如上皮细胞、乳腺细胞等细胞Ca2+内流的主要机制。当细胞受到刺激后,通过G蛋白偶联受体激活PLCγ或PLCβ,将膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)分解为DAG和IP3, IP3作用于内质网上的IP3门控通道,清空内质网Ca2+库,进而激活细胞膜上的SOC通道,从而引起细胞外Ca2+内流。STIM1作为一种钙离子感受器,通过位于内质网内的EF-hand结构域感受内质网内钙离子浓度的变化。当内质网内Ca2+浓度下降时,它就会聚集并转位于内质网膜和细胞质膜交汇处的近膜区,激活orail分子,从而引起细胞外钙离子内流,从而诱发相应的细胞活动,与钙库调控的钙离子通道有关的Orail和STIM1是乳腺癌细胞在体外迁移和在小鼠体内肿瘤的转移必须的,在高度转移的人的乳腺癌MDA-MB-231细胞中采用RNA干扰下调Orail或STIM1或者用钙池操纵的Ca2+通道的药理学抑制剂处理都能使动物模型中的肿瘤转移减少,而高表达STIM1或ORAI1可以增高乳腺癌细胞的侵袭能力。STIM2也是一个I型跨膜蛋白,与STIM1不同的是,STIM2主要分布在内质网膜上,在细胞膜上没有分布。利用体外共转染技术,将人STIM2和不同的SOC通道共同转染在HEK293细胞上,发现STIM2介导的SOCE经由两种模式实现：钙库依赖和非钙库依赖。目前,STIM2在SOCE中的功能仍然有很多争议,最初的研究中发现,在人类Jurkat T细胞和HeLa细胞中敲低STIM1能强烈的抑制SOCE,而过表达或者下调STIM2对SOCE影响很小,或者没有影响。近来,有文献报导,STIM2既能协同STIM1操控钙流入,也能单独调控钙离子而不需要STIMl。在HEK293, PC12, A7r5, Jurkat T细胞等细胞中,STIM2能强烈的抑制STIM1介导的SOCE。STIM1和STIM2这一相反的功能提示,在SOCE信号通路中,STIM1和STIM2可能相互协调发挥作用。本研究聚焦于STIM1和STIM2分子对乳腺癌细胞迁移的影响,并探讨了STIM1和STIM2影响乳腺癌细胞迁移的调控机制,为阐明调控乳腺癌细胞迁移的分子机制提供了新的实验依据,并为乳腺癌的转移治疗靶点提供了新的线索。目的通过检测不同临床乳腺组织中STIM1和STIM2蛋白表达,不同乳腺癌细胞系中STIM1和STIM2mRNA表达以及蛋白表达,探讨STIM1和STIM2功能及其与乳腺癌转移的关系；观察并验证基因沉默和过表达STIM1对乳腺癌迁移的影响；观察抑制、基因沉默和过表达STIM2对乳腺癌细胞迁移的影响,并探讨其影响转移的钙信号机制。方法1. Oncomine肿瘤数据库检测STIM1和STIM2在不同组织中的mRNA表达水平。2.乳腺癌细胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于5%CO2%,37℃培养箱培养,每周传代2-3次,用0.25%的胰酶消化,取对数生长期的细胞进行实验。3.采用Transwell方法比较不同乳腺癌细胞迁移能力的强弱,采用q-PCR的方法,检测不同迁移能力的乳腺癌细胞系中STIM1和STIM2的mRNA水平,采用免疫印迹的方法,检测不同迁移能力乳腺癌细胞系中STIM1和STIM2的蛋白水平。4.采用0-50μM G418处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞,MTT检测抑制STIM2后人乳腺癌MDA-MB-231细胞活力,采用Transwell实验检测细胞迁移能力；使用Lipofectamine2000转染siRNA-STOM1片段和siRNA-STIM2片段,免疫印迹检测干扰效率,MTT检测转染后人乳腺癌MDA-MB-231细胞活力,采用划痕实验和Transwell实验检测转染后细胞迁移能力；进一步使用Lipofectamine2000分别转染STIM1和STIM2质粒,免疫印迹检测过表达效率,采用Transwell实验检测分别转染STIM1和STIM2质粒后细胞迁移能力的变化。5.采用0-50μM G418处理细胞24h,使用激光共聚焦显微镜观察其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞摄取外钙能力的影响；采用Lipofectamine2000转染分别siRNA-STIM1片段和siRNA-STIM2片段,观察其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞摄取外钙能力的影响；进一步,采用Lipofectamine2000分别转染STIM1和STIM2质粒,观察其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞摄取外钙能力的影响。6.采用0-50μM G418处理细胞24h,使用激光共聚焦显微镜观察其对TG诱导的人乳腺癌MDA-MB-231细胞SOCE的影响；采用Lipofectamine2000转染siRNA-STIM1片段和siRNA-STIM2片段,使用激光共聚焦显微镜观察其对TG诱导的人乳腺癌MDA-MB-231细胞SOCE的影响；进一步采用Lipofectamine2000分别转染STIM1和STIM2质粒,使用激光共聚焦显微镜观察其对TG诱导的人乳腺癌MDA-MB-231细胞SOCE的影响。结果1. Oncomine数据显示,与正常组织相比,STIM1在浸润性乳腺导管癌、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌、肝癌和前列腺癌等肿瘤组织中表达升高；与正常乳腺组织相比,STIM2在乳腺导管内筛状腺癌、浸润性乳腺导管癌、浸润性乳腺癌、乳腺混合性癌伴导管癌、乳腺浸润性导管癌伴小叶癌、乳腺浸润性小叶癌中表达降低。2. Transwell结果显示,MDA-MB-231、BT-549、ZR-75-30细胞为迁移能力较强的细胞系,MCF-7、T-47D、BT-474为迁移能力较弱的细胞系；q-PCR结果显示,与迁移能力较弱的细胞系相比,在迁移能力强的细胞系中,STIM1mRNA表达较高,STIM2mRNA表达较低,免疫印迹结果显示,与迁移能力较弱的细胞系相比,在迁移能力强的细胞系中,STIM1蛋白表达较高,STIM2蛋白表达较低。3.与对照组比较,0-50μM G418处理细胞24h,乳腺癌MDA-MB-231细胞活力无明显改变(P>0.05)。0-50μM G418处理24h后,促进了MDA-MB-231细胞迁移的数量(P<0.05)。MDA-MB-231细胞转染siRNA-STIMl和siRNA-STIM2干扰片段后,蛋白表达下降明显,转染24后,MTT活力检测无明显差异(P>0.05)。下调STIM1表达,划痕实验和Transwell显示,抑制了乳腺癌细胞迁移(P<0.05),而下调STIM2则促进了乳腺癌细胞的迁移(P<0.05)。 Transwell结果显示,过表达STIM1促进了乳腺癌细胞的迁移,而过表达STIM2则抑制了肿瘤细胞的迁移(P<0.05)。4. STIM2抑制剂G418处理细胞24h后,增强了细胞摄取外钙的能力(P<0.05),进一步,下调STIM2能增强细胞摄取外钙的能力(P<0.05),过表达STIM2能降低细胞摄取外钙的能力(P<0.05),而下调或过表达STIM1之后对细胞摄取外钙能力没有影响(P>0.05)。5.与对照组比较,STIM2抑制剂G418处理细胞24h后,对TG诱导的内质网最大Ca2+释放峰值(第一个峰,P>0.05)无明显影响,增强了最大Ca2+内流峰值(第二个峰,25μM:P=0.255,50μM:P=0.022)。与对照组比较,分别转染了STIM1和STIM2后TG诱导的最大Ca2+释放峰值(第一个峰,P>0.05)均无明显变化,转染STIM1干扰片段细胞最大Ca2+内流峰值(第二个峰,p<0.01)明显降低,转染STIM2干扰片段后细胞最大Ca2+内流峰值(第二个峰,p<0.01)升高。与对照组比较,过表达STIM1和STIM2后,TG诱导的最大Ca2+释放峰值(第一个峰,P>0.05)均无明显变化,但是过表达STIM1后最大Ca2+内流峰值(第二个峰,P<0.05)明显升高,而过表达STIM2后最大Ca2+内流峰值(第二个峰,P<0.05)则出现下降。结论1.在正常组织和对应肿瘤组织中STIM1和STIM2mRNA表达存在差异；2.在不同乳腺癌细胞系中STIM1和STIM2mRNA表达和蛋白表达存在差异；3.基因沉默STIM1,抑制乳腺癌细胞的迁移,过表达STIM1促进乳腺癌细胞的迁移；抑制或基因沉默STIM2,促进乳腺癌细胞的迁移,过表达STIM2抑制乳腺癌细胞的迁移。4. STIM1和STIM2对乳腺癌细胞迁移的调控是通过调控外钙内流完成的,STIM1促进内质网钙库清空引起的胞外钙内流,而STIM2抑制胞外钙内流。