铁在多种生理和病理过程中发挥着关键作用,是人体不可缺少的微量元素之一。人体内铁的吸收和循环具有完善的控制系统,从而维持铁稳态。在某些病理条件下,长期铁摄入量大于铁消耗量会导致体内铁的总量升高,从而引起铁过载。过量的铁会通过Fenton和Haber-Weiss反应产生羟基自由基,引起脂质过氧化、DNA氧化损伤等,进而引起一系列并发症,如肝功能衰竭,肾功能衰竭,神经衰退性疾病等。铁螯合剂是目前常用的治疗铁过载疾病的方法。铁螯合剂治疗是通过螯合剂选择性地与铁离子螯合形成铁螯合物,从而降低游离铁含量。目前,去铁酮（DFP）,去铁胺（DFO）和地拉罗司（DFX）是临床上常用的治疗铁过载类疾病的三种小分子铁螯合剂。然而,这些铁螯合剂的半衰期短,需要连续多次给药,患者顺应性差。因此,高分子铁螯合剂近年来受到越来越多的关注。与小分子铁螯合剂相比,高分子铁螯合剂的半衰期较长。目前报道的右旋糖苷-DFO、淀粉-DFO、二甲基丙烯酰胺-DFP等高分子铁螯合剂均显著延长了螯合剂的半衰期。然而在开发有效的聚合物铁螯合剂时,除了延长药物半衰期外,还必须考虑许多因素,例如高分子的毒性、铁螯合效率、选择性、稳定性等。高分子胶束是一种重要的纳米载体,两亲性嵌段高分子在水相介质中可以自组装形成具有疏水内核和亲水外壳的核-壳胶束。它的亲水性外壳,可以保持载体的生物相容性和血液循环稳定性,能够提高药物分子在体内的半衰期;疏水性小分子药物位于胶束的疏水内核,可以避免增溶有机溶剂的使用。多肽作为药物载体具有易于代谢及无毒等优势,多肽容易与m PEG-NH₂连接形成两亲性高分子。基于以上背景,本课题组的前期工作设计并合成了以聚乙二醇-聚谷氨酸（m PEG-P（Glu））为骨架,3-羟基吡啶-4-酮（DFP-NH₂）侧链的刷状高分子型铁螯合剂（m PEG-P（Glu-DFP））,以期延长小分子去铁酮的半衰期,降低给药频率。在实验中,我们发现m PEG-P（Glu-DFP）还可以提高螯合铁效率,小分子去铁酮螯合铁的比例为3:1,而聚合物胶束m PEG-P（Glu-DFP）中DFP螯合铁的比例小于3:1,即等量的DFP可以螯合更多的铁离子。m PEG-P（Glu-DFP）提高螯合铁效率是因为高分子自组装形成胶束,限制了小分子DFP的空间自由度进而提高了螯合铁效率。此外,顺铂是目前临床上最常用的化疗药物之一。然而顺铂的半衰期短,毒副作用大,生物利用度低,且易产生耐药性。为了改善上述问题,前期研究利用携带羧基侧链的刷状两亲性高分子与铂键合（COOH-Pt）来延长顺铂的半衰期并降低其毒副作用。然而,羧基和铂通过离子键结合的方式不够稳定,在体循环过程中药物会大量损失。为了增加高分子-顺铂络合物的稳定性,本课题利用m PEG-P（Glu-DFP）与顺铂配位形成交联纳米胶束,从而增加载体稳定性。此外,肿瘤组织内铁代谢异常,具有较高的铁含量。基于DFP与铁离子的较强配位能力,肿瘤微环境内铁离子通过与m PEG-P（Glu-DFP）竞争性络合来释放顺铂。基于以上背景,本课题在水溶液和模型细胞中比较了高分子m PEG-P（Glu-DFP）自组装形成胶束前后的螯合铁效率证明纳米胶束具有较高的铁螯合效率。另外,顺铂具有稳定的结构,不易与金属螯合剂发生反应,我们通过将其活化为Pt（II）（NH₃）₂（H₂O）₂]（NO₃）₂,进而与DFP螯合剂络合。本课题通过一系列表征证明了DFP可以螯合活化后的顺铂,并验证了铁离子能引起DFP-Pt络合物中铂离子的释放。本课题首先合成了m PEG-P（Glu-DFP）高分子,其化学结构通过核磁共振氢谱确得到确认,聚合度为12,接枝率为83%,分子量为8,000 Da。因为接枝率未达到百分之百,为了排除未连接DFP部分的谷氨酸和胶束本身是否会影响高分子胶束的铁螯合铁效率,本课题组用没有铁螯合能力的N,N-二异丙基乙二胺（DPEA）代替DFP做侧链合成了对照组高分子m PEG-P（Glu-DPEA）,其聚合度为12,接枝率为83%,分子量为7,860 Da。然后通过原子吸收光谱法（AAS）评价前期工作合成的未连接侧链DFP的聚合物骨架m PEG-P（Glu）和对照组高分子m PEG-P（Glu-DPEA）的铁螯合效率,所得配体和铁的比例分别为46.1±1.0和150.9±9.8,与m PEG-P（Glu-DFP）中DFP和铁的比例为2.4±0.3相比,两者对铁螯合效率几乎没有影响。本课题通过测定m PEG-P（Glu-DFP）的临界胶束浓度（CMC）,高分子胶束在磷酸盐缓冲液（PBS）及胎牛血清（FBS）中的粒径变化来评估胶束的稳定性。首先通过芘-荧光探针法,测定聚合物m PEG-P（Glu-DFP）的临界胶束浓度（CMC）为13.1±0.5μg/m L,低CMC数值说明胶束具有良好的稳定性,可以保证胶束在体循环中的完整性。通过动态光散射（DLS）分析表明胶束粒径在PBS中保持恒定,说明胶束在PBS中具有良好的稳定性。本实验利用罗丹明（Rh B）标记的胶束m PEG-P（Glu-DFP）-Rh B研究了该纳米胶束的血清稳定性。Rh B包裹在胶束内核时,由于聚集作用会导致一定程度的Rh B的荧光淬灭,当部分胶束在FBS中发生膨胀或破坏时,Rh B的荧光会增强。实验结果发现,胶束在FBS中荧光变化缓慢且变化曲线在3 h后接近稳定,进一步证明了该纳米载体具有良好的血清稳定性。因此,m PEG-P（Glu-DFP）胶束可作为药物载体提高递送效率。为验证m PEG-P（Glu-DFP）高分子自组装对螯铁效率的影响,本课题考察了两种高分子水溶液,一种浓度高于CMC,另一种浓度低于CMC,考察并比较了他们的螯合铁效率。选择钙黄绿素（Calcein）作为荧光探针,其本身具有荧光,当溶液中存在游离铁离子时,游离铁会与calcein结合形成calcein-Fe复合物,使其荧光淬灭;当加入铁螯合剂后,螯合剂会与calcein-Fe竞争铁离子,进而释放calcein,使其荧光恢复。在calcein溶液中加入等量的铁离子使其荧光淬灭。随后分别加入游离DFP或m PEG-P（Glu-DFP）恢复calcein的荧光。实验结果表明,高分子浓度低于CMC时,游离DFP和m PEG-P（Glu-DFP）恢复calcein荧光的能力相同,说明m PEG-P（Glu-DFP）处于分散状态时,与游离DFP具有等同的铁螯合铁效率。当高分子浓度大于CMC时,m PEG-P（Glu-DFP）自组装形成胶束,较低的浓度就可以恢复calcein的荧光。这一现象说明m PEG-P（Glu-DFP）铁螯合效率的提升确实是因为自组装胶束的形成。本课题选择小鼠胚胎成纤维细胞（3T3细胞）,在细胞水平对高分子胶束的螯铁效率做了评估。首先,我们用枸橼酸铁铵（FAC）处理细胞,构建铁过载细胞,并通过Rh B标记的高分子胶束来观察细胞的铁过载程度和胶束的摄取情况。当细胞铁过载后,胶束进入细胞螯合更多铁离子,会形成比较致密的结构,导致Rh B荧光淬灭。通过比较Rh B的荧光强度,本课题证明了通过FAC培养可以构建铁过载细胞模型。并且铁螯合胶束可以被正常细胞和铁过载细胞摄取。为了进一步比较高分子形成胶束前后在细胞水平上的铁螯合铁效率是否存在差异,本课题选择Calcein acetoxymethyl ester（Calcein-AM）作为荧光探针进行细胞内铁含量的半定量分析。Calcein-AM可穿过细胞膜进入活细胞,被细胞摄取后,通过细胞内酯酶将非荧光Calcein-AM转化为荧光calcein。calcein不能穿透细胞膜,它可以与细胞内的铁发生可逆的螯合形成calcein-Fe复合物,导致calcein的荧光淬灭。当加入铁螯合剂培养细胞时,铁螯合剂进入细胞会与calcein-Fe复合物竞争铁,从而释放calcein,恢复其荧光。为了排除细胞对游离DFP和胶束摄取差异的影响,我们分别用DFP和Rh B标记的聚合物m PEG-P（Glu-DFP）-Rh B培养细胞,然后将细胞破碎,通过高效液相定量细胞内液中游离DFP的含量,通过酶标仪测Rh B的荧光定量细胞内液中高分子胶束的含量。实验结果表明,游离DFP和聚合物胶束的摄取率分别是2.7±0.2%和2.8±0.1%（p<0.05）,说明细胞对两者的摄取没有显著性差异。随后,为了在细胞水平比较高分子形成胶束前后螯铁效率的差异,我们分别用50μM的DFP,5μM（>CMC）的m PEG-P（Glu-DFP）聚合物胶束（含50μM DFP）,10μM的DFP,1μM m PEG-P（Glu-DFP）（CMC）,胶束组calcein荧光显著增强,表明当高分子自组装形成胶束后,在细胞中的铁螯合效率增强,即相比于小分子DFP,高分子去除同样的铁,需要更少的DFP。为了提高顺铂与聚合物载体结合的稳定性,减少顺铂递送过程中的损失,本课题假设了m PEG-P（Glu-DFP）中DFP可以与活化后的顺铂中Pt离子螯合。为了验证这一假设,我们首先用游离DFP螯合活化后的顺铂,通过紫外光谱的变化证实DFP确实可以与活化后的顺铂螯合,并且螯合比为2:1。为了比较高分子以配位键方式螯合铂离子的稳定性高于以羧基和铂离子形成离子键的结合方式。本课题以m PEG-P（Glu-DFP）为实验组载体,以m PEG-P（Glu）为对照组载体,两者分别与活化后的顺铂孵育,制备了m PEG-P（Glu-DFP-Pt）和m PEG-P（Glu-Pt）,其中的Pt含量均通过原子吸收分光光度法（AAS）测定,两者中配体与Pt的比例均接近2:1。为了比较两者的稳定性,本课题首先用PBS稀释相同浓度的m PEG-P（Glu-DFP-Pt）和m PEG-P（Glu-Pt）,当加入2000倍的PBS时,m PEG-P（Glu-DFP-Pt）发生一定程度膨胀,但粒径仍保持在300 nm以下,而m PEG-P（Glu-Pt）已完全崩解,说明m PEG-P（Glu-DFP-Pt）比m PEG-P（Glu-Pt）具有更好的抗PBS稀释稳定性。当分别加入1.5倍和1.7倍的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）破坏胶束时,胶束m PEG-P（Glu-DFP-Pt）比m PEG-P（Glu-Pt）的粒径变化较小,说明m PEG-P（Glu-DFP-Pt）比m PEG-P（Glu-Pt）具有更好的抗DMF破坏稳定性。分别用Rh B标记m PEG-P（Glu-DFP-Pt）和m PEG-P（Glu-Pt）研究了两种纳米胶束的血清稳定性,实验结果表明m PEG-P（Glu-DFP-Pt）的荧光变化缓慢,说明m PEG-P（Glu-DFP-Pt）在血清中的稳定性更好。三种稳定性实验均证明m PEG-P（Glu-DFP-Pt）比m PEG-P（Glu-Pt）具有更高的稳定性。因此m PEG-P（Glu-DFP）通过配位键螯合顺铂有望减少顺铂内化过程中的释药损失。为了验证铁离子是否能引起DFP-Pt复合物中铂离子的释放,本课题在DFP-Pt复合物中加入铁离子,因为DFP-Fe复合物在480 nm附近有明显的紫外吸收峰,并且m PEG-P（Glu-DFP-Fe）的水力学半径比m PEG-P（Glu-DFP-Pt）小。本课题通过在复合物中加入铁离子后的紫外波谱变化以及粒径变化确定了在DFP-Pt复合物中加入铁离子后,会形成新的DFP-Fe复合物。由于DFP与铁的结合力更强,铁离子可以作为刺激源释放DFP-Pt复合物中的顺铂。本课题选择小鼠乳腺癌细胞（4T1细胞）,通过细胞毒性间接考察了细胞内铁离子能否诱发m PEG-P（Glu-DFP-Pt）复合物中的铂离子的快速释放。首先使用30μM的DFP螯合细胞内铁离子构建缺铁型4T1细胞,然后测量小分子顺铂和m PEG-P（Glu-DFP-Pt）复合物在正常4T1细胞和缺铁4T1细胞中的毒性。实验结果表明,小分子顺铂和m PEG-P（Glu-DFP-Pt）复合物在正常4T1细胞中的半数致死量(IC₅₀)分别为20.7±1.0μM和16.3±2.2μM,在缺铁细胞中的IC₅₀值分别为15.3±1.6μM和20.7±2.2μM。因为DFP本身有一定的细胞毒性,小分子顺铂在缺铁细胞中IC₅₀值变小是由于DFP本身毒性造成的,而m PEG-P（Glu-DFP-Pt）复合物在缺铁细胞中的IC₅₀值变大是因为细胞内铁含量降低导致铂离子释放减少,进一步证明了细胞内的铁离子可以刺激释放m PEG-P（Glu-DFP-Pt）复合物中的铂离子。综上所述,本课题证明了铁螯合高分子m PEG-P（Glu-DFP）自组装形成纳米胶束后能够有效地提高铁螯合效率,从而降低小分子铁螯合剂的使用剂量和相关毒副作用。这一研究为利用高分子胶束治疗铁过载类疾病提供了新载体和新方法。此外,本课题还利用高分子中的铁螯合基团螯合小分子顺铂,通过配位键与顺铂络合提高了药物稳定性,同时开发并验证了一种新型的药物释放方式:铁离子刺激释放顺铂。本课题构建了一种新型的铁离子应答型顺铂纳米递送系统,为解决小分子顺铂存在的半衰期短,毒副作用大等问题提供了一种新策略。