论文部分内容阅读
本实验旨在为细菌原生质体融合子的筛选提供一种崭新而便捷的免疫学筛选方法，省去传统方法中繁琐费时的遗传标记的筛选步骤。首次将Dot-ELISA方法用于细菌原生质体融合子的筛选，研究了其最佳工作条件；制备了干酪乳杆菌和纳豆菌两种兔抗血清，并用建立的Dot-ELISA方法对其特异性进行了检验；采用Dot-ELISA方法成功筛选出稳定的干酪乳杆菌和纳豆菌的原生质体融合子；对干酪乳杆菌和纳豆菌的最佳RAPD引物进行了筛选，用RAPD方法对Dot-ELISA方法筛选出的融合子进行了鉴定，主要结果如下：1．研究了Dot-ELISA的最佳工作条件，包括两种抗原的最佳菌体浓度、两种抗血清的最佳稀释浓度、酶标抗体的最佳稀释浓度、底物液的显色时间，确定了Dot-ELISA的最佳工作条件为：抗原菌体浓度10~8cfu，A抗血清稀释1∶40，B抗血清稀释1∶80，酶标抗体稀释1∶400，底物液的显色作用时间为5分钟。制备了干酪乳杆菌和纳豆菌两种兔抗血清，通过交叉吸收试验除去了血清中的交叉抗体，用Dot-ELISA方法检验，确定吸收后的两种抗血清均为特异性抗血清，可用于进一步的融合子筛选。2．对文献中的方法略作改进，成功制备了干酪乳杆菌和纳豆菌两种原生质体，并对其进行融合，通过调节再生培养基的pH及控制再生时间从而对融合子再生菌落进行初筛，为进一步筛选目的融合子节省工作并提高筛选效率。用已建立的Dot-ELISA方法筛选出融合子34株。对筛选出的34株融合子进行遗传稳定性试验，传代8代后，只有4株菌F1、F2、F3、F4生长良好，再用Dot-ELISA方法进行检验，其中只有2株菌F1、F2仍为双阳性反应，F3、F4只与B血清显色，与A血清反应不显色，由此判断F1、F2为稳定的融合子，而F3、F4经稳定性传代回复为亲本纳豆菌。3．对干酪乳杆菌和纳豆菌的最佳RAPD引物进行了筛选，结果显示，随机引物S250和S256扩增出的条带多态性及重复性较好，用这两条引物对Dot-ELISA方法最终筛选出的稳定融合子F1和F2及回复菌株F3、F4进行RAPD扩增，结果表明，F1和F2具有双亲共有的条带，分别与每个亲本有共同条带，还有双亲所没有的新条带，F1和F2与A．K．16的相似率为57.1％～66.7％，与B．N．10的相似率为30.8％～44.4％，与两亲本的相似率均高于两亲本之间的相似率；而F3和F4与亲本B．N．10条带一致，由此判断F1和F2确为干酪乳杆菌和纳豆菌的融合子，而F3、F4回复为纳豆菌，RAPD鉴定结果与Dot-ELISA方法筛选结果一致，从而证明Dot-ELISA方法用于细菌融合子的筛选是可行的。