据统计,疏水性药物在已有的药物递送系统(Drug Delivery System,DDS)中占40%-60%,而在新发现的具有疗效的化合物中,疏水性化合物的比例约为70%,此外,40%的活性化合物因为其水溶性差,无法制备成合适的剂型,因而被放弃研究。提高疏水性药物的溶解度,将具有疗效的化合物制备成合适的剂型是药剂学中急需解决的问题之一。紫杉醇在临床上主要作为治疗进展期卵巢癌的一线药物被广泛使用,但其疏水性极强,临床上常用的紫杉醇注射液采用聚氧乙烯蓖麻油増溶。由于聚氧乙烯蓖麻油会引起机体严重的超敏反应,在给予紫杉醇注射液之前要进行抗过敏处理,给药步骤繁琐,毒副作用强且患者依从性差;因此,通过其他递送系统解决该问题具有重要的临床应用价值。另一方面,大量研究表明纳米乳给药系统具有增加难溶性药物溶解度、保护药物免受氧化或水解、增加药物稳定性、增加药物在胃肠部位的滞留时间、提高疏水性药物的生物利用度等优点,是增加难溶性药物口服生物利用度的的理想剂型。但目前广泛研究的纳米乳,制备时需要大量使用乳化剂和助乳化剂,存在一定的安全隐患,且必须采用高能分散方法得到小粒径的纳米乳。基于上述问题,本课题提出以自组装法构建纳米乳液,将其作为疏水性药物紫杉醇的新型递送系统,期望增加紫杉醇的溶解度与生物利用度,进而提高疗效。为此,首先合成了一段为聚乙烯醇(PEG),另一段含有β-环糊精(β-CD)的亲水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD],利用其中β-CD与苄醇的主-客体作用自组装制备水包油型纳米乳液;结合紫杉醇在苄醇中的良好溶解性,得到载药纳米乳液。自组装方式制备纳米乳液时,不需要使用高浓度的乳化剂和助乳化剂,且制备过程简便,给药前不需要预处理,以此制备的载药纳米乳液能有效提高紫杉醇的口服生物利用度,提高疗效的同时降低了副作用。方法1.亲水性共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]的合成以三聚光气活化天冬氨酸苄酯得到N-羧基-L-天冬氨酸-苄酯-环状酸酐(BLA-NCA),然后与分子量5 k Da的端氨基PEG共聚形成聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯共聚物(PEG-PBLA),之后通过炔丙基胺的氨基反应得到PEG-P[Asp(PPA)CD],最后通过其与单叠氮基取代的β-CD间的‘点击’化学反应,得到亲水性共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]。采用红外、核磁等方法表征聚合物的结果,明确共聚物的组成。2.自组装纳米乳液的构建与表征以PEG-P[Asp(PPA)CD]水溶液为水相,以苄醇为油相,通过简单的涡旋方式,利用β-CD与苄醇间的主客体作用在油水界面自组装形成纳米乳;同时考察不同油相体积对纳米乳形成的影响。制备载药纳米乳时,将溶有紫杉醇的苄醇溶液涡旋分散于PEG-P[Asp(PPA)CD]水溶液中即可得到。通过激光共聚焦显微镜对其形态进行表征,以激光粒度仪测定其粒径、粒径分布和多分散性指数(PDI)。3.载药纳米乳液的稳定性研究将自组装载药纳米乳液于4℃和37℃条件下保存,不同时间点通过激光粒度仪测定纳米乳的粒径与PDI,高效液相色谱法(HPLC)检测药物含量的变化,同时观察纳米乳外观的变化,以此评价其稳定性。4.自组装载药纳米乳液的体外释放采用透析法对自组装载药纳米乳液的体外释放进行评价,以p H 7.4的PBS缓冲液为释放介质或模拟胃肠道环境下p H条件。不同时间点取样,HPLC法检测药物含量。5.自组装载药纳米乳液的体外抗肿瘤活性将人肺癌细胞A549与小鼠黑色素瘤细胞B16F10与不同浓度的载药纳米乳液共孵育24 h后,通过MTT法测定细胞存活率以初步评价自组装载药纳米乳的体外抗肿瘤活性。6.自组装载药装纳米乳液的体内药代动力学研究SD大鼠尾静脉注射或口服载药纳米乳液后,不同时间点取血,通过液质联用技术检测大鼠血液中的紫杉醇的浓度,并运用DAS软件分析其药代动力学参数。7.自组装载药纳米乳液的体内抗肿瘤疗效研究构建裸鼠的A549移植瘤模型,待肿瘤大小约150 mm3时给予药物治疗,记录其体重变化和肿瘤体积变化,14天后处死取肿瘤组织和脏器记录其重量,并计算脏器指数,对主要的病理学切片进行苏木精-伊红(H&E)染色分析,同时检测血常规水平和主要生化水平。8.自组装载药纳米乳液的急性毒性评价单次尾静脉注射大剂量载药纳米乳液于昆明小鼠,观察14天并记录小鼠的体重变化情况。14天后处死小鼠,取主要脏器记录其重量,并计算脏器指数。同时,进行H&E染色病理学分析,同时检测小鼠的血常规水平和主要生化水平。结果:1.成功合成了亲水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD],并通过核磁共振氢谱特征吸收峰与红外吸收曲线对比证实得到了预期产物。2.通过主-客体作用介导的自组装法制备了水包油型纳米乳液,激光粒度仪测得纳米乳液的平均粒径为12 nm,PDI为0.26,激光共聚焦显微镜下观察纳米乳液外观呈均匀球形,边缘清晰。3.为期两个月的稳定性试验表明,自组装载药纳米乳液粒径、PDI及药物含量无明显变化,稳定性好。4.自组装载药纳米乳液在p H 7.4条件下24 h的累积释放率为81.8%,前4个小时的累积释放率为74.3%,在模拟胃肠道环境下24 h的累积释放率为77.9%,前4小时的累积释放率为62.3%。5.自组装载药纳米乳液有较好的体外抗肿瘤活性,与A549细胞共孵育24 h后细胞存活率为22.6%,而B16F10细胞共孵育24 h后细胞存活率为10.0%。6.大鼠口服或静脉注射自组装载药纳米乳液均产生较高的血药浓度:口服后自组装载药纳米乳液的最高血药浓度为4.22μg/m L,静脉注射后自组装载药纳米乳液的最高血药浓度为16.22μg/m L。7.口服或静脉注射自组装载药纳米乳液均能抑制A549移植瘤肿瘤的生长,具有较好的抗肿瘤活性。8.自组装载药纳米乳液有良好的安全性,毒副作用较低。结论:本课题成功地合成了亲水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD],并通过主-客体介导的自组装的方式构建了纳米乳液载药系统用于递送疏水性药物紫杉醇;由该方法构建的自组装载药纳米乳液有良好的稳定性与体外释放速率,体内给药后能有效地提高紫杉醇的口服生物利用度,在体内外能够抑制肿瘤生长,体内治疗不会导致明显的毒副作用,初步安全性评价表明该纳米乳具有良好的体内安全性。