论文部分内容阅读
干扰素(Interferon，IFN)是一类由细胞分泌的，至少在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性和在不同途径上影响细胞的代谢、生长和分化的蛋白质。目前已有商品化的猪、鸡、犬等重组干扰素产品在市场上应用，但是水貂干扰素国外还未见相关报道。国内仅中国农业科学院特产研究所野生动物人兽共患病研究室应用RT-PCR方法从体外诱导的水貂外周血淋巴细胞中扩增出水貂的α干扰素13种基因(MiIFN-α)亚型，其他还未见相关报道。近几年我国毛皮动物产业发展较迅速，是国际上少数毛皮动物养殖业发达的国家之一，尤其在吉林、辽宁、黑龙江、河北、山东、内蒙古等地区，养殖水貂已成为当地农民增收致富的主要途径，目前水貂存栏量达3000万只，毛皮动物产业是我国农村产业结构调整的重要产业。近年来，貂、狐狸、貉等犬科动物作为特种经济动物饲养正在兴起，而犬科动物各种病毒性疾病是造成死亡的最重要原因。干扰素对病毒具有广谱、特效的抗病毒感染作用。所以，为进行犬科动物干扰素制剂的研究，我将从以下几个方面进行研究，为重组水貂干扰素的开发奠定了基础，并且分析针对一种犬科动物的干扰素是否适用于所有犬科动物，为临床治疗及饲养管理提供指导。
1.根据GenBank上发表的雪貂IFN-α基因(EU863613.1)，雪貂IFN-β基因(EF581890.1)cDNA全序列，在阅读框外侧两端保守区分别设计一对引物；直接从脾脏组织中提取总RNA，反转录后以cDNA作为模板扩增IFN-α和IFN-β基因，获得了MiIFN-α基因和MiIFN-β全长基因，MiIFN-α长度为564bp；MiIFN-β基因全长为561bp。将水貂IFN-α基因序列与GenBank上收录的雪貂(EU863613.1)核苷酸同源性为94.3％，氨基酸同源性为89.3％；与雪貂(EU863614.1)核苷酸同源性为95.0％，氨基酸同源性为90.9％；与雪貂(EU863615.1)核苷酸同源性为95.5％，氨基酸同源性为91.4％。水貂IFN-β基因序列与GenBank上收录的雪貂(EF581890.1)核苷酸同源性为100.0％，氨基酸同源性为100.0％；与雪貂(EF368208.1)核苷酸同源性为98.2％，氨基酸同源性为98.4％。另外，将扩增的基因序列与犬、貉、赤狐、大熊猫进行基因序列比对，发现MiIFN-α核苷酸序列同源性78.1％-99.3％之间。氨基酸同源性在66.3％-98.4％之间。犬和赤狐的IFN-α亲缘关系最近(同源性接近98.0％)，犬和貉的IFN-α亲缘关系也比较近(同源性达98.0％)，而水貂和赤狐、貉、犬的亲缘关系相对较远(基因同源性79.1％左右，氨基酸同源性66.3％～67.9％)。MiIFN-β核苷酸序列同源性在83.0％～100.0％之间，氨基酸同源性在69.4％-100.0％。水貂与雪貂、犬与赤狐的IFN-β亲缘关系最近(同源性为100.0％)，犬和貉的IFN-β亲缘关系也比较近(同源性达98.4％)，而水貂和赤狐、貉、犬的亲缘关系相对较远(基因同源性86.0％左右，氨基酸同源性73.7％～75.3％)。
2.以MiIFN-α全长基因序列和MiIFN-β全长基因序列为模板，根据表达载体的酶切位点设计成熟肽基因表达引物，目的基因亚克隆入PET32a-MiIFNα、PET32a-MiIFNβ原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。表达产物SDS-PAGE分析，两种重组干扰素目的蛋白均以包涵体的形式存在，MiIFN-α重组蛋白大小约为42KDa；MiIFN-β重组蛋白大小约为43KDa。