香菇多糖（lentinan）是从香菇（lentinus edodes）子实体中提取出的大分子多糖聚合物。其药用价值已被许多国家和地区肯定，近年来的相关研究还表明香菇多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒、抗感染等作用。目前临床上已将香菇多糖作为抗肿瘤的辅助用药，但其作用机制尚不明确，在一定程度上影响了香菇多糖的临床应用。因此本文以香菇为原料，制备均一分子量的香菇多糖，并通过体内体外两方面深入研究香菇多糖抗肿瘤的分子机制。本课题采用水提醇沉法、过氧化氢脱色和超滤法分级分离得到香菇多糖，并测定多糖含量和分子量，考察其对不同肿瘤细胞的抑制作用。通过体外实验研究香菇多糖在形态学上对H22细胞的影响及诱导其凋亡的作用。通过建立小鼠的肿瘤模型研究香菇多糖在体内的抗肿瘤活性，并进一步探究其体内抗肿瘤作用的分子机制。　　第一部分：香菇多糖的制备及其对不同肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性考察　　本实验以房县小冬菇为原料，采用水提醇沉法提取出香菇粗多糖，经过氧化氢脱色及超滤分级分离得到分子量均一的精制香菇多糖。采用苯酚硫酸法测定糖含量，紫外扫描鉴定其纯度，高效凝胶色谱法测定其相对分子量。采用MTT法测定其对鼠肝癌细胞H22、人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、人胃癌细胞MKN45、MKN28的生长抑制率。　　香菇子实体经过水提醇沉、脱色、超滤等步骤制备香菇多糖，苯酚硫酸法测得糖含量为98.86％，紫外扫描图谱显示不含蛋白质及核酸，高效凝胶色谱法测得相对分子量为6.621×105Da。香菇多糖对H22、HepG2、SMMC-7721、MKN45细胞体外增殖具有显著的抑制作用，最大抑瘤率分别达到24.69％、31.63％、36.25％、31.39％，增殖抑制效果与香菇多糖浓度呈正相关性，但香菇多糖对MKN28细胞增殖无明显影响,可见香菇多糖对不同的肿瘤细胞具有选择性抑制作用。　　第二部分：香菇多糖体外诱导H22细胞凋亡作用的研究　　以体外培养的鼠肝癌细胞H22作为香菇多糖体外诱导细胞凋亡的研究对象,采用Annexin V/PI双荧光标记流式细胞术和AO/EB双荧光染色法检测H22细胞的凋亡，电子显微镜（SEM）观察不同香菇多糖浓度下 H22细胞凋亡过程中细胞形态的变化。　　香菇多糖与H22细胞共培养24h后，在流式细胞仪双变量散点图上确定H22细胞的早期凋亡和晚期凋亡，高剂量组（2mg/mL）凋亡率可达15.48％，其凋亡率与香菇多糖浓度成正相关性。AO/EB双荧光染色法定性定量观察H22细胞凋亡变化，结果显示：活细胞核染色质被染成绿色呈正常结构,早期凋亡细胞核染色质着绿色或暗绿色，呈固缩状或圆珠状并伴有核结构的变化，晚期凋亡细胞核染色质为橘红色，呈固缩状或圆珠状并半有凋亡小体的形成，死亡细胞核染色质呈橘红色并成正常形态。不同浓度的香菇多糖与H22细胞共培养12h后，用扫描电镜观察H22细胞在凋亡过程中形态学上的变化。随着香菇多糖浓度的增加，细胞表面发生凋亡形态变化的比例逐渐增高。与空白对照组相比，香菇多糖给药组的细胞表面变皱、细胞萎缩、胞体变小，凋亡细胞通过发芽、起泡等方式形成凋亡小体，并最终破裂形成细胞碎片。　　本课题采用流式细胞术和AO/EB双荧光染色定性定量观察香菇多糖对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，并首次采用扫描电镜观察香菇多糖诱导肿瘤细胞凋亡时细胞的形态学变化。实验结果表明，香菇多糖能够诱导肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞出现一系列细胞凋亡特有的形态学变化。　　第三部分：香菇多糖对H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用及分子机制研究　　取50只BALB/c小鼠，雌性，4-6周龄，体重18-22 g，右腋下接种H22瘤细胞。次日，将BALB/c小鼠随机分为五组，每组10只。另取10只作为空白对照组，阴性对照组每日腹腔注射生理盐水0.2mL，连续注射10天；阳性对照组连续注射环磷酰胺（25mg/kg）10天；香菇多糖给药组分为低剂量组（50mg/kg）、中剂量组（100mg/kg）和高剂量组（200mg/kg）,连续腹腔注射10天。实验过程中，每隔一天称重一次。实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏、胸腺和H22肿瘤组织，称重后分别计算脾指数、胸腺指数和抑瘤率。蛋白质免疫印迹法（western blot）检测肿瘤组织中细胞凋亡的信号因子和细胞周期蛋白cyclin B1、cyclin D1的表达。　　对空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和香菇多糖给药组的器官指数分别进行计算，脾指数平均值分别为4.25mg/g、7.36mg/g、3.65mg/g、9.38mg/g、11.79mg/g、14.27mg/g。与阴性对照组相比，香菇多糖给药组能够促进脾细胞增殖，其中中、高剂量组与阴性对照组比较具有显著性差异（P<0.05），而阳性对照组能够显著性抑制脾细胞增殖（P<0.05）。与空白对照组相比，香菇多糖低、中、高剂量组均能显著性促进脾细胞增殖（P<0.05）；胸腺指数平均值分别为2.48 mg/g、2.42mg/g、0.97mg/g、2.25mg/g、2.07mg/g、1.58mg/g。与阴性对照组和阳性对照组相比，香菇多糖低、中剂量组对胸腺细胞的影响并不明显，但高剂量组对胸腺细胞有抑制作用，表明香菇多糖只有在一定浓度范围内才对胸腺细胞无明显影响。与对脾脏的作用相似，阳性组同样出现胸腺细胞受到抑制的现象；香菇多糖给药组中三个剂量组的抑瘤率分别达到26.20％、33.62％、48.13％，随着给药剂量的增加，香菇多糖对肿瘤的抑制作用增强。Western blot法检测结果表明，与阴性对照组相比，香菇多糖组上调Bax/Bcl-2、p53的含量，能够活化caspase-3蛋白，说明香菇多糖可能是通过线粒体膜途径起到促进细胞凋亡的作用。在细胞周期蛋白的检测中，香菇多糖能够抑制cyclin B1蛋白的表达而对cyclin D1蛋白的表达无明显影响，提示香菇多糖可能通过抑制细胞周期蛋白B1的表达而使细胞阻滞在G2/M期。　　综上，香菇多糖一方面通过调节凋亡相关蛋白的表达，使肿瘤细胞启动凋亡程序，促进细胞凋亡，另一方面又通过影响细胞周期蛋白的表达，使肿瘤细胞有丝分裂受到影响，细胞增殖受到抑制，肿瘤细胞有丝分裂受到阻滞后，又必然会启动自身的凋亡程序，最终也使肿瘤细胞发生凋亡。本课题首次确定了香菇多糖直接诱导肿瘤细胞发生凋亡的可能分子机制，为香菇多糖的临床应用和联合用药提供了理论基础。