【摘 要】
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目的:果糖二磷酸醛缩酶A（ALDOA）是我们前期应用DIGE荧光差异双向电泳技术/结合基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（2-DE/MALDI-TOF/TOF）技术平台由临床肺鳞癌及癌旁组织样本筛选并鉴定出的与肿瘤转移相关的新蛋白。我们前期的研究结果表明ALDOA与肺鳞癌的发生发展密切相关,但目前国内外尚未有ALDOA与肺癌细胞凋亡的相关报道。本研究旨在探讨ALDOA对肺癌细胞凋亡的影响及其作用的
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目的:果糖二磷酸醛缩酶A（ALDOA）是我们前期应用DIGE荧光差异双向电泳技术/结合基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（2-DE/MALDI-TOF/TOF）技术平台由临床肺鳞癌及癌旁组织样本筛选并鉴定出的与肿瘤转移相关的新蛋白。我们前期的研究结果表明ALDOA与肺鳞癌的发生发展密切相关,但目前国内外尚未有ALDOA与肺癌细胞凋亡的相关报道。本研究旨在探讨ALDOA对肺癌细胞凋亡的影响及其作用的分子机制。方法:1.实验室前期已经成功建立了 ALDOA稳定下调的人肺鳞癌NCI-H520细胞株和空质粒稳定转染细胞株,本实验首先通过Western blotting方法检测ALDOA在亲本组（WT）、阴性对照组（shvector）和转染ALDOA干扰序列的实验组（shALDOA-1、shALDOA-2）四株细胞中的表达情况,验证转染效率。2.为了筛选ALDOA低表达的肺癌细胞系作为瞬时转染的靶细胞,我们应用Western blotting的方法检测了 HBE、NCI-H520、A549、973、H157五株肺癌细胞系中ALDOA的表达情况,并筛选出ALDOA低表达的肺癌细胞系,进一步通过瞬时转染的方法,将pcDNA4.0-ALDOA和空载体pcDNA4.0导入到ALDOA低表达的肺癌细胞株中,构建ALDOA高表达细胞系。反向验证ALDOA对肺癌细胞凋亡的影响。3.利用顺铂（CDDP）,模拟化疗的方式来诱导肺癌细胞凋亡。4.通过DAPI染色和流式细胞术（flow cytometry analysis,FCM）两种方法检测ALDOA下调后对顺铂诱导的细胞凋亡的影响。并进一步在ALDOA高表达细胞系中进行反向验证。5.实验中进一步采用Western blotting方法,检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2 在 ALDOA 下调后的表达情况,同时在ALDOA高表达细胞系中进行反向验证。6.通过Western blotting方法检测 Caspase-8、Cleaved-Caspase-8 及 Caspase-9、Cleaved-Caspase-9 的蛋白表达情况,进而探讨ALDOA参与内源性及外源性凋亡通路的情况。7.利用免疫荧光技术检测线粒体中细胞色素C的变化。结果:1.Western blotting结果表明,与亲本组（WT）和阴性对照组（shvector）相比,转染ALDOA干扰序列的实验组（shALDOA-1、shALDOA-2）的总蛋白中ALDOA表达下调（*p<0.05）。2.Western blotting方法筛选低表达ALDOA的肺癌细胞系,结果显示:ALDOA蛋白在肺腺癌细胞系H157中表达较低,将pcDNA4.0-ALDOA和对照空质粒pcDNA4.0成功转染到H157细胞中,建立ALDOA高表达的细胞系。3.DAPI染色和流式细胞仪分析ALDOA表达干扰后细胞的凋亡情况:在加入顺铂诱导凋亡之后,较亲本组（WT）和阴性对照组相比,转染ALDOA干扰序列的实验组（shALDOA-1、shALDOA-2）细胞凋亡率增加（*p<0.05）;同时在ALDOA高表达细胞系中也得到了反向验证。4.Western blotting结果显示:ALDOA基因干扰后,细胞对凋亡刺激的敏感性增强,促进了Caspase-3蛋白的剪切同时Bcl-2蛋白表达量显著降低（*p<0.05）,而Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Bax 的蛋白表达量显著增加（*p<0.05）;同样在ALDOA高表达细胞系中也得到了反向验证。5.ALDOA下调导致Cleaved-Caspase-8 及 Cleaved-Caspase-9 蛋白表达量显著增加（*p<0.05）。6.ALDOA表达干扰后细胞色素C由线粒体向细胞质释放,荧光强度明显增强。结论:1.ALDOA表达干扰后,促进顺铂诱导的细胞凋亡,ALDOA高表达以后抑制顺铂诱导的细胞凋亡。2.同时,在分子水平上发现ALDOA表达干扰后Caspase-3的酶原剪切为有活性的Cleaved-Caspase-3,并伴随着PARP的剪切形式Cleaved-PARP表达显著增加;此外,ALDOA高表达后,Caspase-3的酶原及其下游底物PARP的剪切均受到抑制。提示ALDOA通过影响Caspase-3酶原的激活,及其下游底物PARP的剪切来调控细胞凋亡。3.ALDOA通过影响Bax/Bcl-2的比例调控细胞凋亡。4.ALDOA可同时参与外源性及内源性两个通路调控细胞凋亡。5.ALDOA表达干扰后细胞色素C由线粒体向细胞质释放,说明线粒体膜的通透性发生了改变。
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