ABCE1基因稳定过表达肺腺癌细胞株的建立及其对肺腺癌体内外生物学功能的影响

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:silawangyue
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目的:   肺癌已经成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,是肿瘤防治的重要对象。近年来,随着分子生物学的发展,肺癌的治疗效果取得了长足的进步,但肺癌患者的总体生存率及生活质量仍不乐观。因此,迫切需要探索肺癌发生、发展的分子机理,为发展有效的治疗手段提供新靶点和理论依据。   前期研究工作中,我们应用mRNA差异显示技术及激光俘获显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM)在手术切除的小细胞肺癌及转移淋巴结组织中筛选出肺癌转移表型相关的一个差异表达基因,经克隆和测序后证明该基因为ABCE1。随后我们证明了ABCE1 mRNA和蛋白在肺癌及转移淋巴结内的表达高于癌旁组织,并与临床分期相关。我们在体外实验中应用RNAi技术下调ABCE1基因表达,明显降低了肺癌细胞的增殖与侵袭能力,同时若干肺癌相关基因的表达也随之发生变化。以上结果表明,ABCE1可能与肺癌的发生发展密切相关,有必要对ABCE1基因在肺癌中的作用进行更深入的研究。   ABCE1(ATP-bindng cassette transporter E1,ATP结合盒转运子E1)基因属ATP结合盒转运子基因亚家族,它的cDNA编码一种分子量为68KD的蛋白,通过特异性抑制RNase L来阻断2-5A/RNase L通路,参与细胞抗病毒、增殖、抗凋亡过程,并可能在某些肿瘤的发生、发展、转移中发挥功能。另一方面ABCE1蛋白在促进蛋白质合成及细胞增殖分化过程中发挥着重要作用。但是,关于ABCE1对于肿瘤影响的相关研究不多,上调该基因是否影响肺癌的生物学行为至今没有报道。更重要的是,ABCE1在体内动物模型内是否对肺癌也具有促进作用的研究也是空白的。因此我们在本研究中建立过表达ABCE1基因的细胞株,在此基础上进行体外细胞生物学实验及体内裸鼠成瘤实验,进一步验证ABCE1基因在肺癌中的功能,为ABCE1作为潜在的肺癌诊断参考或是治疗靶点提供理论和实验依据。   方法:   通过基因克隆技术构建能够携带绿色荧光且可过表达ABCE1的质粒载体,经酶切、电泳和DNA测序验证pEGFP-C1-ABCE1表达载体构建成功。在此基础上将其转染肺腺癌细胞株LTEP-A-2,G418筛选并建立能稳定过表达ABCE1基因的细胞株,结合实时定量RT-PCR、Western blot验证过表达效率。通过MTT、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell小室实验、检测细胞周期及凋亡情况,比较稳定转染pEGFP-C1-ABCE1的过表达细胞、稳定转染pEGFP-C1的空载体细胞、对照组细胞三组细胞增殖、侵袭、细胞周期、凋亡等方面的差异,评价过表达ABCE1基因后,LTEP-A-2细胞增殖、侵袭能力的变化及机制。应用裸鼠皮下成瘤实验,将三组肺腺癌细胞注射到免疫缺陷的BALB/C裸小鼠背部侧翼,构建裸鼠皮下成瘤模型,通过记录各组裸鼠成瘤时间、绘制生长曲线、测量瘤重、解剖裸鼠、进行病理及分子生物学分析,分组比较,进一步验证过表达ABCE1对LTEP-A-2肺腺癌细胞在体内的成瘤能力,以及对增殖、侵袭能力的影响。   结果:   ABCE1基因编码序列已被克隆至真核表达载体pEGFP-C1,经酶切、电泳和DNA测序验证序列正确。将其转染LTEP-A-2肺腺癌细胞,转染48小时后转染效率最高,经G418筛选,成功筛选出了稳定过表达ABCE1基因的LTEP-A-2肺腺癌细胞株。经实时定量RT-PCR、Western blot检测显示过表达组细胞的ABCE1mRNA和蛋白水平明显高于空载体组和对照组。与其它两组相比,稳定过表达组LTEP-A-2细胞增殖能力、非停泊性生长能力及侵袭能力明显提升,但细胞周期分布和凋亡无明显变化。三组细胞注射裸鼠后,全部裸鼠皮下形成肿瘤(21/21)。过表达组的成瘤率较空载体组和对照组无明显差异,而成瘤时间明显缩短。过表达组裸鼠皮下肿瘤的在体生长速度快于其它两组,最终形成的肿瘤体积、重量高于其他两组。过表达组裸鼠其中3只(3/7)由于肿瘤负荷过大出现消瘦及恶病质状态,同时伴有肿瘤向周围器官侵袭性生长,造成胸腔内播散和右上肢功能障碍,其它两组无此类表现。解剖三组裸鼠未发现明显远处转移。瘤体取材病理切片发现过表达组的恶性行为高于其他两组,免疫组化及Western blot验证瘤体内过表达组的ABCE1蛋白水平高于空载体组和对照组。   结论:   1、成功构建pEGFP-C1-ABCE1表达载体并筛选及建立稳定过表达ABCE1基因的LTEP-A-2肺腺癌细胞。   2、过表达ABCE1基因促进LTEP-A-2肺腺癌细胞的增殖、非停泊性的生长成集落能力、以及侵袭能力;对于LTEP-A-2肺腺癌细胞的细胞周期分布及凋亡无明显影响。   3、ABCE1促进LTEP-A-2肺腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力,并且在形成肿瘤后增强肿瘤的增殖、侵袭能力,影响肺腺癌的进展过程。
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