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第一部分 外泌体微小RNA和人免疫缺陷病毒感染人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1, HIV-1)是获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, ADDS)的病因。获得性免疫缺陷综合征是由于HIV-1感染导致免疫系统损伤的征候群。HIV-1通过感染和破坏人体免疫细胞,逐渐损伤宿主抗感染和抗某些肿瘤的能力。海洛因是一种十分常见的静脉注射毒品,许多注射吸食海洛因的个体有HIV-1感染。静脉吸毒共用针头是HIV-1感染的一个重要因素。外泌体是一种直径为30-100 nln的膜囊泡,可被多种细胞分泌,广泛分布于各种体液中包括血浆。外泌体在细胞间的相互联系中发挥重要作用。微小RNA(miRNA)是在动植物中发现的一类小的(约22个核苷酸)非编码的调节性的RNA,在转录后的目的基因调控中发挥重要作用,能参与机体的天然免疫。MiRNA和外泌体在HIV-1疾病进程中均扮演了一定的角色。最近的研究表明,外泌体内含有miRNA,且能传递给受体细胞并在受体细胞中发挥作用。目前关于外泌体中miRNA和HIV-1的关系尚不明确。目的：以32例正常健康人,37例HIV-1感染者(无海洛因吸毒史),25例注射海洛因者,19例HIV-1感染的海洛因使用者为研究对象,探讨HIV-1感染和／或海洛因滥用对血浆外泌体中miRNAs的影响。方法：实验分为两部分：1.体内实验,用实时定量PCR,微阵列的方法直接检测临床样本中血浆外泌体miRNAs的表达情况；2.体外实验,利用免疫荧光,实时定量PCR, ELISA检测HIV-1感染后的外泌体对巨噬细胞TNF-a表达的影响。结果：HIV-1感染的海洛因使用者的血浆外泌体中有6种miRNAs (16, let-7a, 146a,29c,21,126)表达增加。经美沙酮(Methadone)替代治疗(>5年)后,这些血浆外泌体miRNAs可恢复到正常水平。通过比较血浆外泌体]miRNAs的变化和病毒载量/CD4细胞数量的关系,我们发现有四种miRNAs (150, 146a,29b, let-7a)升高和HIV-1疾病进展相关。经抗逆转录病毒治疗(Antiretroviral therapy, ART)后,miRNA150和miRNA29b相对于未治疗者有所降低,但是let-7a升高。我们还通过微阵列检测了血浆外泌体中84种miRNAs的表达。结果显示,HIV-1感染和/或海洛因滥用能增加56种外泌体miRNAs的表达。此外,我们研究了HIV-1感染对外泌体功能的影响。实验表明,携带有HIV--1的J1.1细胞来源的外泌体能增加肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)和1miRNA16在巨噬细胞中的表达。结论：HIV-1感染和/或海洛因滥用导致血浆外泌体中1miRNAs的表达异常,这可能是HIV-1感染造成机体免疫失调,病毒得以复制和持续致病的重要机制之一。第二部分温度对天然免疫的影响猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)感染恒河猴是一种广泛用于研究HIV-1/AIDS的非人灵长类模型。恒河猴的正常体温(38.5℃C远高于人类的37℃,目前尚无有关猴的正常体温(38.5℃)对猴细胞培养和SIV感染影响的报道。目的：探讨猴的正常体温(38.5℃)对猴细胞培养和SIV感染的影响,优化体外猴细胞培养模型。方法：我们首先用MTT法检测了两种温度是否影响猴细胞(PBMCs, macrophages)活性。接着,我们在两种温度下培养并感染细胞,运用实时定量PCR检测SIV gag基因的表达。此外,使用实时定量PCR,流式细胞术对38.5℃影响SIV复制的相关机制进行了探讨。结果：38.5℃培养不影响细胞的活性,但能明显地增强SIV gag基因的表达。对其机制的研究显示,38.5℃培养不影响艾滋病毒受体CD4和CCR5在PBMCs的表达。但是,38.5℃培养能增加巨噬细胞表面CD4的表达。鉴于T细胞激活和巨噬细胞分化有利于艾滋病毒感染和复制,我们检测了38.5℃对T细胞激活标志物(CD69, CD25)以及巨噬细胞分化标志物CD16的影响。结果显示,38.5℃培养对CD25和CD16的表达无明显影响,但对CD69的表达有增强作用。此外,我们还研究了温度对Ⅰ型干扰素(Interferon, IFN)和]miRNA的影响。Ⅰ型干扰素是重要的抗病毒因子。干扰素调节因子(Interferon regulatory factor, IRF)和干扰素刺激因子(Interferon stimulated gene, ISG)是Ⅰ型IFN信号途径中重要的调控因子。我们的研究发现,38.5℃培养PBMCs不影响Ⅰ型IFN的表达,但可降低IRF3和ISG54的表达。MiRNA在病毒和机体的相互作用过程中发挥着重要作用,某些miRNAs还能影响病毒的复制。我们检测了两种温度下分化的巨噬细胞中四种抑制SIV复制的1miRNAs的表达。结果显示,38.5℃培养巨噬细胞抑制了四种SIV限制性miRNAs (29a,29b,9,146a)的表达。结论：38.5℃体外培养对免疫细胞的影响：1.增力PBMCs激活标记物CD69的表达,降低PBMCs IRF3和ISG54的表达；2.增加巨噬细胞CD4的表达,降低抗SIV的miRNAs的表达。此外,38.5℃培养能增加SIV在PBMCs和巨噬细胞复制。因此,为了使体外实验结果和体内实验吻合,使用恒河猴细胞的有关SIV感染的体外实验要考虑到温度的因素。