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背景和目的:肾脏是衰老较快的器官,肾脏衰老的主要病理特点是肾小球局灶硬化、肾小管萎缩、间质纤维化和炎细胞浸润。本实验室的早期研究发现,ILK可以加速肾脏衰老和纤维化过程,然而ILK促进肾纤维化进而参与肾脏衰老的机制目前尚不完全清楚。研究发现ILK的活化可下调肠、乳腺和肾小管上皮细胞E-cadherin的表达,而E-cadherin则在某些组织中参与细胞间连接的调控。晚近有研究发现TGFβ1可通过connexin43促进心肌成纤维细胞向纤维母细胞分化,因此我们假设ILK参与肾纤维化和肾脏衰老的过程可能是通过调控细胞间通讯实现的。由于connexin43是肾脏细胞最重要的细胞间连接蛋白,因此本研究首先观察人血浆ILK水平和大鼠肾组织ILK、connexin43表达随增龄的变化;然后观察正反义转染ILK基因对系膜细胞connexin43表达的影响;并分别应用AKT、GSK3的特异性抑制剂LY294002、SB415286抑制系膜细胞AKT和GSK3磷酸化,观察其对connexin43表达影响,进一步探讨ILK调控connexin43参与肾脏衰老的机制。方法:(1)采用整群随机抽样的方法,抽取80例健康北京社区居民,其中老年组62例,年龄68.36±6.16岁,青年组18例,年龄21.57±2.92岁。ELISA法检测血浆中ILK含量。青年组和老年组ILK水平的比较应用t检验,采用pearson相关和多元线性回归分析影响老年组ILK水平的因素。(2)留取3月龄、24月龄Wistar大鼠(n=6)肾组织和血清标本,检测血肌酐、尿素氮,石蜡切片行PAS染色,间接免疫荧光法检测肾组织ILK、connexin43表达,RT-PCR、Western Blot法检测肾组织内ILK、connexin43、FN、COLⅣ表达。(3)将ILK质粒转染至大鼠肾小球系膜细胞中,G418筛选后得到稳定表达的ILK阳性系膜细胞,并应用ILK SiRNA瞬时转染系膜细胞,观察上调和下调ILK基因表达对系膜细胞connexin表达的影响;应用RT-PCR、Western blot检测上调ILK基因对系膜细胞FN、COLⅣ、P16、P21表达的影响;分别提取细胞浆和细胞核蛋白,观察上调ILK基因对系膜细胞胞浆和胞核AKT、磷酸化AKT表达的影响。应用LY294002、SB415286抑制正常系膜细胞AKT和GSK3磷酸化,观察对connexin43表达的影响;并抑制ILK阳性系膜细胞AKT磷酸化,观察ILK抑制connexin43表达是否经由AKT途径。结果:(1)北京社区健康人群老年组血浆ILK水平高于青年组(p＜0.01),老年组ILK水平和年龄正相关(r=0.417,p＜0.05),多元回归分析显示年龄是影响血浆ILK水平的独立危险因素。(2)24月龄大鼠体重、肾重、相对肾重、血肌酐、尿素氮水平均高于3月龄组(p＜0.05,p＜0.01),PAS染色显示24月龄大鼠出现肾小球局灶硬化,局灶肾小管萎缩,间质炎细胞浸润;RT-PCR、Western blot显示肾组织内FN、COLⅣ表达升高(p＜0.05),ILK表达升高(p＜0.05,p＜0.01)和connexin43表达下降(p＜0.05,p＜0.01)。(3)体外研究显示ILK过表达可导致系膜细胞connexin43表达降低(p＜0.05),下调ILK表达则观察到相反结果(p＜0.05,p＜0.01);ILK过表达还可导致系膜细胞胞浆和胞核磷酸化AKT表达升高(p＜0.01)、磷酸化GSK3表达升高(p＜0.01)、细胞增殖能力降低以及SA-βgal阳性细胞增多;抑制AKT的磷酸化后正常系膜细胞connexin43表达升高(p＜0.05),而抑制GSK3磷酸化则无上述作用;应用LY294002抑制ILK阳性系膜细胞AKT的磷酸化则可以观察到ILK对connexin43的负向调控作用减弱。结论:人血浆ILK水平随增龄升高,年龄是ILK升高的独立危险因素,提示ILK可作为评价人群自然衰老的指标。老年大鼠肾组织ILK表达升高和connexin43表达的降低,并出现FN、COLⅣ等的表达增加。ILK可通过AKT途径而非GSK3途径调控connexin43的表达从而参与系膜细胞衰老,ILK的过表达可导致细胞浆和细胞核磷酸化AKT的表达增加,ILK对connexin43的调节可能是通过磷酸化AKT的核转位从而在转录水平实现的。