研究背景与目的:光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）是一种高选择性、低侵袭性的新型抗癌治疗方法,利用光敏剂和氧气分子在光的辅助下产生的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）杀灭肿瘤细胞。然而,PDT的临床应用存在诸多限制。首先,光敏剂在肿瘤中的积累是一个巨大的问题。大多数光敏剂水溶性差,生物利用度低。光敏剂是ROS的发生器,在肿瘤部位积累的光敏剂不足,会直接导致产生的ROS过低,无法达到理想的杀伤效果。促进肿瘤中光敏剂的积累以产生足够的ROS至关重要。其次,缺氧降低了 PDT的治疗效果,因为氧气是PDT过程中产生1O2的必要反应物。在许多肿瘤组织中,由于细胞恶性增殖,血管网络异常,肿瘤内存在大量耗氧和供氧不足的现象。此外,恶性肿瘤的转移发展和抗肿瘤治疗引起的贫血也加剧了肿瘤缺氧,导致肿瘤内缺氧微环境的形成。第三,产生的单线态氧（1O2）易被肿瘤内高含量的谷胱甘肽（glutathione,GSH）消耗。谷胱甘肽含有活性巯基,易被氧化和脱氢,是一种非酶抗氧化剂,在细胞内起到保护作用,能使细胞免受ROS等氧化剂的氧化损伤。癌细胞细胞内的谷胱甘肽水平比正常细胞高1000倍。因此,如何降低GSH对ROS的影响是PDT的一个难题。同时,由于耐受性或其他原因,单一的PDT疗法往往不能达到根除的疗效。与PDT一样,光热疗法（PTT）也是光介导疗法。然而,PTT是依靠产生热量而不是ROS来杀死癌细胞的,因此可以作为PDT的补充手段,弥补PDT的不足。由于其非侵入性和局部性的特点,PTT在过去的几十年里得到了广泛的研究。光热剂在光的激发下产生光热转换产生热量,产生的热量通过热疗诱导细胞凋亡或坏死。本论文设计了一种联合光动力治疗和光热治疗的纳米二氧化锰复合材料,合成了蜂巢状纳米二氧化锰并且通过负载光敏剂Ce6和表面修饰光热剂聚多巴胺进行修饰。纳米二氧化锰的材料特性可以在肿瘤微环境中增强光动力效果,并且联合光热治疗可以增强抑瘤效果。研究方法和内容:1、首先利用KMnO4和OA在O/W乳液界面上发生的“Baeyer test for unsaturation”反应来进行原位塌陷自组装的方法合成蜂巢状纳米二氧化锰hMnO2,通过表面改性增强其表面正电并且可与光敏剂Ce6静电吸附。吸附了Ce6的hMn02-Ce6通过多巴胺在其表面聚合成聚多巴胺层,可以获得hMnO2-Ce6-PDA。通过一些基本的表征手段来考察合成的纳米颗粒,例如DLS、Zeta potential、TEM、SEM、XRD、BET、UV-vis。2、在体外试验探究hMnO2-Ce6-PDA的功能。为了探究hMnO2-Ce6-PDA能否释放氧气,通过溶解氧测量仪测量hMnO2-Ce6-PDA的溶解氧浓度变化。hMnO2-Ce6-PDA溶液预期在660 nm下产生ROS,为了验证ROS产生功能并且探究纳米材料对传统光动力治疗的优化,hMnO2-Ce6-PDA在H2O2和GSH环境中接收660nm光照,利用荧光光谱仪测量ROS荧光探针DCFH的荧光强度变化评估ROS的生成情况。DTNB作为GSH检测指示物可以用来检验hMnO2-Ce6-PDA的消除GSH能力。红外热成像仪用来观察纳米颗粒在808 nm激光下的光热转换能力,探究了纳米颗粒的光热稳定性以及光热转换效率。hMnO2-Ce6-PDA的T1加权MRI成像能力可以用磁共振成像系统来确定。3、为了探究hMnO2-Ce6-PDA的抗肿瘤效果,必须进行生物评价。细胞层面的评价以HepG2肝癌细胞为评估对象,通过荧光显微镜来观察纳米颗粒在HepG2细胞内的ROS成像,激光共聚焦显微镜观察HepG2细胞对纳米颗粒的摄取,确定细胞摄取的周期。通过MTT细胞毒性试验和Calcein-AM/PI活死细胞染色检验了 hMnO2-Ce6-PDA的材料毒性,并且可以探究光照下材料对细胞的杀伤作用。还考察了加入材料后细胞内氧气和GSH含量的变化。4、本文构建了 H22小鼠异位肝癌肿瘤模型对hMnO2-Ce6-PDA的动物体内应用进行研究。通过活体成像系统的荧光成像观察纳米材料在小鼠体内的分布,确定光照治疗的最佳时间。通过小动物磁共振成像系统对小鼠注射纳米材料的肿瘤部位进行T1加权扫描,观察其T1信号强度。注射hMnO2-Ce6-PDA的小鼠肿瘤部位接收808 nm光照后,利用红外热成像仪观察肿瘤部位的热量变化,确定光热治疗的可行性。荷瘤小鼠的抑瘤试验将荷瘤小鼠分为Control组、NP 组、NP+808 nm 组、NP+660 nm 组、NP+808 nm+660 nm 组,观察治疗期间的肿瘤体积、瘤重、体重,以此评价hMnO2-Ce6-PDA的抑瘤效果。治疗小鼠的肿瘤和器官进行H＆E组织切片染色,观察其组织情况,评估生物安全性。结果与结论:1、TEM、SEM的结果显示了合成的纳米二氧化锰形貌为蜂巢状,XRD证实了纳米材料的晶体,BET表征了 hMnO2的疏松介孔结构,通过Zeta potential和紫外可见光光谱证明hMnO2的改性和负载Ce6成功,通过TEM观察了纳米颗粒的结构,证实最后成功合成了 hMnO2-Ce6-PDA。2、hMnO2-Ce6-PDA的体外试验证实了纳米材料的功能。溶氧仪观察到纳米材料在酸性、含H2O2的模拟肿瘤微环境中,有明显的释放氧气现象,证实了 hMnO2-Ce6-PDA可以供氧。红外热成像仪观察到808 nm光照后,纳米材料的溶液明显升温,并且具有良好的光热稳定性,光照3次内升温基本不变。加入ROS探针的纳米材料溶液在660 nm激光下观察到荧光强度的增强,证实了其产生ROS的能力,并且在模拟肿瘤微环境中可以增强ROS产生的能力。磁共振成像系统扫描纳米材料的溶液状态,发现在肿瘤微环境中的T1加权MRI成像能力增强。3、加入hMnO2-Ce6-PDA的HepG2细胞被660 nm激光光照后,可以在荧光显微镜下观察到加入DCFH-DA的HepG2细胞产生荧光,证实其可在细胞中产生ROS。激光共聚焦显微镜可以观察到细胞内有Ce6的荧光,说明hMnO2-Ce6-PDA可以被细胞摄取,并且确定了其在12 h摄取较多。MTT试验和Calcein-AM/PI染色发现了纳米材料对HepG2细胞的暗毒性较低,但在光照后能够明显杀灭细胞。加入纳米颗粒后,细胞内RDPP探针荧光减弱,表明hMnO2-Ce6-PDA能在细胞内产氧使氧气浓度增加。同时加入hMnO2-Ce6-PDA后的细胞经检测发现GSH含量有所下降。4、活体荧光成像观察到纳米材料在小鼠体内的分布,确定了纳米材料蓄积的最佳时间应为6 h,MRI磁共振成像观察到注射纳米材料的小鼠的肿瘤可以产生高T1信号,红外热成像仪可以观察到光热治疗在小鼠肿瘤的治疗效果。观察小鼠的抑瘤实验结果可以发现,PDT和PTT对荷瘤小鼠均有抑瘤效果,PDT＆PTT联合治疗的效果更为明显。H＆E组织切片证明了 hMnO2-Ce6-PDA光介导治疗对小鼠的器官无不良作用,但肿瘤组织遭到了破坏,细胞坏死。