论文部分内容阅读
沙门氏菌(Salmonella)是一类重要的肠道致病菌,会导致动物的腹泻、肠炎、败血症及母畜流产,同时也会感染人,对畜禽养殖及公共卫生意义重大。沙门氏菌包含肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2个种,以及7个亚种和2500多种血清型,我国已报道其中的292种血清型,绝大多数都具有致病性。种类繁多的血清型给沙门氏菌病的诊断和防控带来很大难度。现有的沙门氏菌抗体检测方法在效果上不甚满意,因此挖掘诊断靶点、建立新型诊断技术对该病的防治很有必要。本研究从沙门氏菌的抗体检测方法和疫苗两方面入手,以期为沙门氏菌病的预防和控制提供帮助。本文研究内容如下:1.基于外膜蛋白PagC的沙门氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立与应用本试验通过生物信息学比对和后期试验验证,发现外膜蛋白PagC广泛存在于沙门氏菌各血清型中,在沙门氏菌属属内高度保守、属间特异,确定其适合作为沙门氏菌诊断抗原建立间接ELISA抗体检测方法。将去除信号肽序列的pagC基因克隆至原核表达载体pET-28a中,成功构建重组表达质粒pET-28a-pagC,并转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导得到重组蛋白PagC,用凝胶过滤和亲和层析先后对其进行纯化。以纯化的重组蛋白PagC作为检测抗原建立间接ELISA方法,对该方法的各项反应条件进行了优化。确定ELISA最佳条件为:包被抗原浓度为2 μg/mL,待检血清稀释度为1:50,最佳封闭液是5%脱脂奶粉,待检血清作用时间是60 min,HRP标记抗鸡二抗的稀释度是1:1000,二抗作用时间是60min。经试验验证,建立的方法具有特异性强、重复性好,对主要血清型沙门氏菌均适用等特点。该ELISA方法与Biochek公司的猪沙门氏菌抗体检测试剂盒符合率为83%,与鸡白痢鸡伤寒玻板凝集试验方法符合率为80.6%,与人工感染制备得到的29份鸡白痢标准阳性血清、31份标准阴性血清结果比较符合率为98.3%。用该方法对482份猪临床血清进行检测,总体阳性率为46.7%,感染主要以母猪和种公猪为主;对252份鸡临床血清进行检测,总体阳性率为42.9%。2.表达沙门氏菌外膜蛋白L(OmpL)的重组猪痘病毒活载体疫苗的研制及免疫评价本试验选取了沙门氏菌的保护性抗原ompL,将其插入猪痘病毒基因组内,构建了重组猪痘病毒rSPV-OmpL。通过PCR、Western blot和间接免疫荧光试验,证明该重组病毒可以正确、稳定表达外源基因ompL。用rSPV-OmpL、沙门氏菌灭活疫苗(阳性对照)、SPV亲本病毒(阴性对照)及PBS(空白对照)分别免疫小鼠,其中rSPV-OmpL组的血清OmpL特异性抗体效价显著高于阳性对照组(P<0.05),血清IFN-γ和IL-4水平显著高于三个对照组(P<0.05)。致死剂量鼠伤寒沙门氏菌腹腔注射后,rSPV-OmpL组有80%小鼠存活,极显著高于阴性对照组(P<0.01)。说明重组猪痘病毒rSPV-OmpL作为沙门氏菌候选疫苗具有良好的应用潜力。3.共表达沙门氏菌OmpL和FliC的重组猪痘病毒的构建及其在小鼠模型中的保护效率研究为了进一步开发优良的沙门氏菌疫苗,本试验在构建好的重组猪痘病毒rSPV-OmpL的基础上,再插入沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC,构建共表达沙门氏菌OmpL和FliC的重组猪痘病毒rSPV-OF。通过PCR、Western blot和间接免疫荧光试验,证明该重组病毒rSPV-OF可以同时正确、稳定地表达外源基因ompL和fliC。用重组病毒rSPV-OF、沙门氏菌灭活疫苗(阳性对照)、SPV亲本病毒(阴性对照)及PBS(空白对照)分别免疫小鼠,其中rSPV-OF组的OmpL特异性抗体效价、FliC特异性抗体效价、血清IFN-γ和IL-4水平均显著高于对照组(P<0.05)。致死剂量鼠伤寒沙门氏菌腹腔注射后,rSPV-OF组有70%小鼠存活,说明二价重组猪痘病毒rSPV-OF可作为沙门氏菌疫苗的候选物,且具有进一步开发优化的前景。