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IgE是Ⅰ型超敏反应的主要介导者。IgE是正常人血清中含量最少半衰期最短的免疫球蛋白,健康人血清浓度仅0.3 μg/mL,半衰期约2.5天,但在IgE介导的过敏性疾病患者血清中,IgE水平可高于正常人1000～10000倍并可以维持12天左右。降低患者血液中IgE水平对过敏性疾病的控制具有重要意义。随着血液透析设备、血液透析模式和血液透析技术的更新换代,利用免疫吸附技术(Immunoadsorption,IA)特异性地清除重症过敏症患者血液中的效应分子IgE以控制中至重度过敏症患者的症状将成为可能。免疫吸附技术的核心技术是免疫吸附配基的研制。本课题组的目的是研制出能与IgE高亲和力结合的配基,而IgE分子的获得是其配基研制和筛选的基础。IgE分子由两条重链和两条轻链组成,其重链恒定区与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体FcεRI的结合是Ⅰ型超敏反应发生发展的关键步骤。IgE重链恒定区有4个区域,完整的IgE分子和IgE重链2-4区(IgE heavy chain 2-4 region,IgE Cε2-4)与FcεRIα结合的亲和力接近,因此重组表达人IgE Cε2～Cε4可用于替代完整的IgE分子,本实验室前期以原核表达系统表达的人IgE Cε2～4蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体,研究发现最终筛选出的单克隆绝大多数并不能与天然IgE分子结合,出现该结果的原因可能是原核表达的免疫原无翻译后修饰,蛋白不能很好的折叠,导致制备的抗体与天然IgE分子的亲和力低。相比较于原核表达系统,哺乳动物细胞表达系统具备活性蛋白所必须的空间结构和修饰,能够为重组人源蛋白提供最接近于天然状态的翻译后修饰。因此,本研究拟通过人肾胚细胞293FT真核表达系统分泌表达人IgE Cε2-4蛋白,并采用表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)靶标垂钓人血清中与之相互作用的蛋白,为进一步研制和筛选IgE免疫吸附配基奠定基础。本研究分为两部分:第一部分,人IgE重链2-4区(IgECε2-4)蛋白的真核表达及纯化。选用真核表达载体pcDNA3.1(-),构建3个含不同信号肽的IgECε2-4重组真核表达载体,分别瞬时转染HEK 293FT悬浮细胞,收集细胞培养上清Western blot鉴定不同重组质粒的表达量,优化选用表达量最高的重组质粒进行等比例扩大表达重组蛋白,镍柱亲和层析纯化重组蛋白。细胞免疫荧光化学染色鉴定重组蛋白IgECε2-4与KU812细胞表面IgE受体FcεR Ⅰ的结合能力。Western blot结果显示,含信号肽SP3的重组质粒表达量最高,因此选用含信号肽SP3的重组质粒等比例扩大表达重组蛋白IgECε2-4,多批次瞬时转染表达获得含重组蛋白IgECε2-4的细胞培养上清5L,镍柱亲和纯化获得31 mg高纯度的重组人IgECε2-4蛋白。瞬时转染研究过程耗时短,适用于大通量、高效率地表达蛋白,符合本实验需求。细胞免疫荧光化学染色鉴定结果显示重组蛋白IgECε2-4可与KU812细胞表面受体结合,表明人IgECε2-4蛋白的空间结构折叠正确。本实验通过真核表达纯化获得重组人IgECε2-4蛋白,为后续靶标垂钓其相互作用蛋白以及IgE免疫吸附配基的制备奠定基础。第二部分,采用表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)靶标垂钓人IgECε2-4的相互作用蛋白。SPR是一种光学物理传感技术,可通过检测附着在传感芯片表面的介质层的折射率与厚度改变而引起反射光的折射率等光谱变化来分析检测生物分子相互作用。SPR技术以其无需标记、特异性强、灵敏度高、微量检测、分析速度快等优点,已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号传导、受体一配体、抗体一抗原分子垂钓、新药筛选等生命科学领域。本实验将重组人IgECε2-4蛋白固定于3D葡聚糖芯片上,使用美国Plexera的生物分子相互作用仪PlexArray HTA100,靶标垂钓捕捉人血清中与人IgECε2-4相互作用的蛋白,原位酶解芯片上的蛋白后,使用液相色谱-质谱联用分析技术(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)分析捕获到的蛋白。质谱结果分析显示,通过SPR技术捕获到人血清中37种可能与IgECε2-4结合的蛋白。综合以上实验结果得出结论:本研究成功构建了人IgECε2-4蛋白真核表达载体,瞬时转染293FT悬浮细胞表达重组蛋白,亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白人IgECε2-4蛋白;细胞免疫荧光化学染色结果显示真核表达获得的重组人IgECε2-4蛋白能与人白细胞表面FcεR1α受体结合。重组人IgE Cε2-4蛋白的制备为后续其靶分子捕获及IgE免疫吸附剂的筛选提供了材料。SPR技术靶标垂钓捕获到人血清中与人IgE Cε2-4蛋白存在直接或间接结合作用的蛋白37种,为IgE免疫吸附剂的研制提供依据,进而为IgE介导的过敏性疾病的免疫吸附治疗奠定基础。