论文部分内容阅读
胶质瘤是神经胶质细胞癌变所产生的最常见的颅脑恶性肿瘤,其中胶质母细胞瘤(GBM)是恶性程度最高、最具有侵袭性的一类胶质瘤,易对化疗和放疗产生耐药性,因此,胶质母细胞瘤病人的复发率高,一年生存率低。此外,胶质母细胞瘤的发病机制复杂,且尚不清楚。因此,深入了解胶质母细胞瘤发生的分子机制,设计靶向药物,可以为胶质母细胞瘤治疗提供新的线索。活化T细胞核因子(NFATs)是一类转录因子家族,具有多向调节功能,尤其在免疫反应中,对其下游靶基因的转录起重要作用。NFATs家族有5个成员:NFAT1(NFATc2,NFATp),NFAT2(NFATc1,NFATc),NFAT3(NFATc4),NFAT4(NFATc3,NFATx)和NFAT5(TonEBP,OREBP)。现有研究表明,NFATs也参与肿瘤的发生,其中NFATc1是原癌基因,促进肿瘤的发生,而NFATc2则可抑制肿瘤的形成。NFATs脱磷酸活化后进入细胞核,单独或与其他蛋白共同作用发挥转录因子功能,而发生磷酸化后,从核内转位到细胞质中,失去其转录因子活性。我们发现,在HEK293T细胞中,双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶A(DYRK1A)可以磷酸化NFATc1,增加其稳定性,相反,DYRK1A磷酸化NFATc2则促进了其降解。为了进一步验证这一现象是否在胶质母细胞瘤中(GBMs)具有一致性,且这一分子机制是否可以影响GBMs的致癌进程,我们又在GBMs中进行了实验,发现DYRK1A呈现高表达,且与NFATc1的表达呈正相关,抑制DYRK1A促进了 NFATc1的降解、抑制NFATc1的转录活性,反之亦然。而DYRK1A对NFAT家族的另一成员NFATc2的作用则相反。我们发现,DYRK1A对NFATc1的S261、S278、S403和S409位点的磷酸化,干扰了 NFATc1的泛素化和蛋白酶体降解,从而增加NFATc1的蛋白稳定性;而来源于NFATc1的DYRK1A靶向位点的多肽竞争性地阻断了作用在NFATc1上的DYRK1A激酶活性,明显地破坏了 NFATc1蛋白的稳定。更重要的是,抑制DYRK1A影响了胶质母细胞瘤的迁移能力。因此,我们认为,NFATc1在胶质母细胞瘤中的高表达促进了胶质母细胞瘤的迁移,是一个关键的致病因素。基于NFATc1上DYRK1A作用位点设计的多肽药物可以抑制DYRK1A促进NFATc1活性的能力,并且抑制GBMs的迁移。此多肽药物可能是针对胶质母细胞瘤的一种有前景的干预、治疗手段。研究目的:1.明确DYRK1A调控NFATc1的分子机制2.明确DYRK1A调控NFATc1对胶质母细胞瘤发生、发展的机制研究方法:1.高表达DYRK1A或敲低DYRK1A的表达,对NFATc1蛋白表达的影响,及是否影响NFATc1核转移1.1高表达DYRK1A后增加了 NFATc1蛋白的表达水平,敲低DYKR1A反之减少NFATc1的蛋白表达。将 p-NFATc1mycFLAG 分别与 pCMV-DYRK1A 或 pGFP-V-RS-shDYRK1A 共转染至HEK293细胞中,培养48小时后提取细胞蛋白,使用小鼠anti-flag抗体通过免疫印迹法检测NFATc1蛋白表达。再于HEK293细胞中转染pCMV-DYRK1A,使用anti-NFATc1抗体检测内源性NFATc1表达差异。将pWT-NFATc2和pCMV-DYRK1 A共转染HEK293细胞,用anti-HA抗体检测NFATc2表达。1.2 将 p-NFATc1mycFLAG 与 pCMV-DYRK1 A 或 pGFP-V-RS-shDYRK1 A 共转染至HEK293细胞,收取细胞后分离核、质蛋白,使用anti-NFATc1抗体检测核、质中NFATc1的表达差异。在HEK293细胞中加入NFAT激活剂Ionomycine(离子霉素),收取细胞,分离核、质蛋白,使用anti-NFATc1抗体检测细胞核与细胞质中NFATc1的表达差异,判断其活化状态的核转移。2.证明DYRK1A调控NFATc1泛素化和稳定性。2.1用蛋白酶体抑制剂laccystin(lac)处理转染过p-NFATc1mycFLAG的HEK293细胞,并设置0小时、6小时、12小时、24小时的不同作用时间,以及0 μ M、2.5 u M、5 μ M的不同作用浓度。用溶酶体抑制剂氯喹(ch1)处理转染p-NFATc1mycFLAG的HEK293细胞,同样设置与上述一致的作用时间和作用浓度。用anti-NFATc1抗体检测NFATc1表达。2.2 在 HEK293 细胞中分别转染 p-NFATc1mycFLAG 与 p-NFATc2mycFLAG 高表达质粒,使用Cullin-1/2dn结构物作为SCF-E3连接酶抑制剂,分别用anti-NFATc1、anti-NFATc2抗体检测NFATc1与NFATc2表达变化。HEK293细胞高表达NFATc1后,分别用 anti-flag 抗体、anti-ubiquitin 进行免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),再分别用 anti-ubiquitin 和 anti-flag 抗体进行蛋白印迹(western blot,WB)检测,验证NAFTc1与ubiquitin结合情况。3.证明DYEK1A通过磷酸化调控NFATc1蛋白的降解和稳定性3.1在HEK293细胞中共转染p-NFATc1mycFLAG与pCMV-DYRK1A质粒,实验组中加入DYRK1A抑制剂骆驼蓬碱harmine,使用anti-flag抗体WB检测NFATc1表达量。将pCMV-DYRK1A转染至HEK293细胞,48小时后提取总蛋白,分别使用anti-pSer抗体和anti-NFATc1抗体通过WB检测磷酸化NFATc1与总NFATc1蛋白表达量。3.2 在 HEK293 细胞中共转染 p-NFATc1mycFLAG 与 pCMV-DYRK1A 质粒,48 小时候提取总蛋白,分别使用anti-flag、anti-DYRK1A做co-IP,通过WB分别检测DYRK1A、NFATc1,验证二者相互作用关系。高表达DYRK1A后,用anti-ubiquitin做co-IP,通过anti-flag抗体WB检测ubi-NFATc1复合物。4.确定DYRK1A在NFATc1上的磷酸化位点4.1使用ClustalW2多序列分析工具,预测NFATc1蛋白结构域中含有的RPX(S/T)P位点,按照预测位点位置,分别构建截短体片段质粒。4.2在HEK293细胞中,分别将截短体片段质粒p-NFATc 1-1-433mycFLAG、p-NFATc1-1-308mycFLAG、p-NFATc1-1-272mycFLAG、p-NFATc1-307-716mycFLAG、p-NFATc1-424-716mycFLAG 与 pCMV-DYRK1A 共转染,用 anti-flag 抗体检测总NFATc1蛋白表达量;重复上述共转染步骤,48小时后提取细胞总蛋白,用anti-DYRK1 A抗体做co-IP,通过WB实验用anti-flag抗体检测各截短体NFATc1蛋白,明确各截短体NFATc1与DYRK1A结合情况。4.3预测各截短体片段中潜在磷酸化位点,并构建点突变质粒,将碱基序列中的丝氨酸残基S261、S278、S403和S409突变为丙氨酸。在HEK293细胞中将构建的截短体点突变NFATc1质粒分别与pCMV-DYRK1A共转染,48小时后提取细胞总蛋白,通过WB实验,用anti-flag抗体检测各截短体NFATc1蛋白表达量。同样在HEK293细胞中转染NFATc1全长质粒p-NFATc1mycFLAG以及9个截短体点突变质粒,并加入5 μM蛋白酶体抑制剂乳胞素。转染24小时后提取细胞总蛋白,通过WB实验检测乳胞素组与对照组的NFATc1蛋白表达差异。5.DYRK1A与NFATc1在胶质瘤中高度协同表达,并明确在细胞中的表达定位。5.1用组织芯片和免疫组化(IHC)分析检测正常组织和不同级别胶质瘤中DYRK1A和NFATc1的蛋白表达水平。5.2培养GBM细胞系,U87、U251和T98G以及正常的人星形胶质细胞NHA和非胶质瘤细胞系HEK293作为对照,提取细胞总蛋白检测,分别使用anti-DYRK1A和anti-NFATc1抗体检测内源性DYRK1A和NFATc1的表达。5.3在胶质瘤细胞系U251中,通过免疫荧光实验,检测DYRK1A与NFATc1在细胞中定位。6.分析DYRK1A和NFATc1在胶质瘤转录水平及其与预后的关系,并验证在胶质瘤细胞中DYRK1A增加NFATc1蛋白表达量和转录因子活性。6.1分析肿瘤基因组图谱(TCGA)的RNA-seq数据,分别得到DYRK1A及NFATc1在胶质瘤GBM和非肿瘤组织中的转录水平。进一步分析TCGA和KM P1otter数据中DYRK1A和NFATc1转录水平与胶质瘤患者的生存与预后的相关性。6.2在T98G细胞系中转染pCMV-DYRK1A质粒,48小时后提取细胞总蛋白,通过WB实验,用anti-NFATc1抗体检测内源性NFATc1的蛋白表达。同样,在T98G细胞系中转染psh-DYRK1A质粒干扰掉DYRK1A,培养48小时后提取细胞总蛋白,通过WB检测内源性NFATc1的蛋白表达。6.3在T98G细胞中共转染pCMV-DYRK1A以及含有IL-12启动子区序列的pNFAT1uc报告基因质粒,培养24小时后,通过双荧光素酶报告基因实验检测NFATc1的转录因子活性。同样,T98G细胞中共转染psh-DYRK1A以及含有IL-12启动子区序列的pNFAT1uc报告基因质粒,培养24小时后,通过双荧光素酶报告基因实验检测NFATc1的转录因子活性。在T98G细胞系中分别转染pCMV-DYRK1A高表达质粒与psh-DYRK1A干扰质粒,48小时后提取细胞总RNA,反转录得到cDNA后,通过RT-qPCR检测NFATc1调控的靶基因IL2和TNFα转录。6.4在T98G细胞中转染p-NFATc1mycFLAG或者共转染染p-NFATc1mycFLAG和pCMV-DYRK1A,通过Cytokine Arrays检测细胞因子表达情况。7.在胶质瘤中DYRK1A对NFATc1及NFATc2的差异性调控。7.1在T98G细胞系中转染pCMV-DYRK1A高表达质粒,培养48小时后提取细胞总蛋白,用anti-NFATc2单克隆抗体和anti-DYRK1A多克隆抗体检测NFATc2和DYRK1A蛋白表达。7.2 pWT-NFATc2与pCMV-DYRK1A共转染T98G细胞,48小时后提取细胞总RNA,反转录获得cDNA,采用qRT-PCR检测NFATs的靶基因IL2和TNF的基因表达。7.3 T98G细胞中共转染psh-DYRK1A、pWT-NFATc2以及含有IL-12启动子区序列的pNFAT1uc报告基因质粒,培养24小时后,进行双荧光素酶报告基因检测。8.DYRK1A调控NFATc1促进胶质瘤细胞的迁移。8.1 在 T98G 细胞中分别转染 p-NFATc1mycFLAG、pCMV-DYRK1A、psh-NFATc1以及共转染 pCMV-DYRK1A、p-NFATc1mycFLAG 和共转染 pCMV-DYRK1A、psh-NFATc1,细胞计数后进行transwell迁移实验。同样,T98G细胞中,分别设计psh-DYRK1 A、p-NFATc1mycFLAG、psh-NFATc1、psh-DYRK1A+p-NFATc1mycFLAG共转染、psh-NFATc1+psh-DYRK1A共转染实验组,细胞计数后进行transwell迁移实验。8.2与上述transwell分组设计相同,在96孔板转染T98G细胞后,使用MTT法检测细胞存活率。9.NFATc1来源的多肽竞争性抑制DYRK1A并且抑制胶质瘤细胞迁移9.1设计NFATc1来源的、含有DYRK1A识别底物的磷酸化位点的多肽序列,分别命名为 NFATc1-P1、NFATc1-P2、NFATc1-P3。T98G 细胞共转染 p-NFATc1mycflag和 pCMV-DYRK1A 后,分别用不同浓度HIV-TAT、DYRK1A 底物、NFATc1-P1、NFATc1-P2、NFATc1-P3多肽处理24小时,提取细胞总蛋白,通过WB实验,用anti-flag抗体检测NFATc1蛋白表达量。9.2用p-NFATc1mycflag和pCMV-DYRK1A共转染T98G细胞,转染后分别用HIV-TAT(80uM)和NFATc1-P3融合多肽(80uM)处理12、24和48小时。提取细胞总蛋白,通过WB实验,用anti-flag抗体检测NFATc1蛋白表达量。9.3用p-NFATc1mycflag和pCMV-DYRK1A共转染T98G细胞,转染24小时后,用HIV-TAT(80uM)和NFATc1-P3融合多肽(80uM)处理细胞。细胞计数后,用transwell小室实验检测细胞迁移能力。实验结果1.DYRK1A影响NFATc1的蛋白表达及核转移1.1高表达DYRK1A后增加了 NFATc1蛋白的表达水平,敲低DYKR1A反之减少NFATc1的蛋白表达。1.2高表达DYRK1A后增加了 NFATc1在细胞质与细胞核的表达,敲低DYKR1A反之减少NFATc1在细胞质与细胞核的表达。DYRK1A影响NFATc1的核转移。2.DYRK1A调控NFATc1泛素-蛋白酶体途径降解进而影响其蛋白稳定性。2.1 NFATc1通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。2.2 NFATc1和NFATc2均可通过SCF E3连接酶介导的泛素蛋白酶体途径降解。3.DYRK1 A通过磷酸化NFATc1调控其泛素化和降解。3.1 DYRK1A 可以磷酸化 NFATc1。3.2 DYRK1A结合NFATc1,进而磷酸化NFATc1。并且DYRK1A通过磷酸化NFATc1调控其泛素化和降解。4.明确NFATc1上的S261、S278、S403和S409是DYRK1A磷酸化位点。4.1分析预测位点位置,分别构建截短体片段质粒。4.2 NFATc1-424-716不能与DYRK1A相互作用,NFATc1序列的第三和第四个基序可能是DYRK1A的作用位点。4.3 NFATc1上的S261、S278、S403和S409是DYRK1A磷酸化位点。5.DYRK1A和NFATc1在胶质瘤及胶质瘤细胞系表达上调,并且两者共定位于细胞质和细胞核中,表明DYRK1A可能通过翻译后调控NFATc1的表达。5.1 IHC结果显示,与正常组织相比,NFATc1、DYRK1A在胶质瘤中的高表达,在4级胶质瘤中表达最高。5.2胶质瘤细胞系中NFATc1水平显著升高。5.3胶质瘤细胞中DYRK1A和NFATc1共定位于细胞质以及细胞核。6.DYRK1A和NFATc1的转录水平均与患者OS和DFS无关。DYRK1A增加NFATc1蛋白表达和转录因子活性。6.1 DYRK1A和NFATc1的转录水平均与患者OS和DFS无关。6.2胶质瘤中,高表达DYRK1A可以增加NFATc1的蛋白水平,相反,敲除DYRK1A减少NFATc 1的蛋白水平。6.3 DYRK1A增加了 NFATc1的转录活性。6.4 DYRK1A显著增加NFATc1调控的各种细胞因子表达,包括IGFBP4、IL1B、IL6等。7.在胶质瘤中,DYRK1A对NFATc2的调控与对NFATc1的调控相反。DYRK1A使NFATc1蛋白水平升高,使NFATc2蛋白水平下降。7.1高表达DYRK1A减少NFATc2蛋白表达。7.2 DYRK1A的过度表达使NFATc2的转录活性降低。7.3低表达DYRK1A增加NFATc2的转录因子活性。8.DYRK1A与NFATc1协同促进胶质瘤细胞迁移。8.1 DYRK1A和NFATc1协同促进T98G细胞迁移。8.2 DYRK1A和NFATc1的过度表达或敲除不会影响细胞活性,迁移作用的改变并不是细胞增殖与存活发生改变而造成的。9.NFATc1来源的多肽竞争性抑制DYRK1A并且抑制胶质瘤细胞迁移。9.1多肽NFATc1-P3有效,且在80 μM浓度下,显著抑制DYRK1A增加的NFATc1蛋白水平,呈剂量依赖。9.2多肽NFATc1-P3在80 μM浓度下,发挥作用效果随处理时间增加而增长,呈时间依赖。9.3多肽NFATc1-P3在80 μM浓度下,胶质瘤细胞迁移。总结DYRK1A通过磷酸化作用影响NFATc1的泛素-蛋白酶体途径的降解,增加NFATc1的蛋白稳定性,并且影响NFATc1的核转移,增强其转录因子活性。并且DYRK1A激活NFATc1,增加胶质母细胞瘤的迁移。来源于NFATc1的特异性DYRK1A抑制多肽药物可作为治疗胶质母细胞瘤的一种新的选择。创新性首次发现DYRK1A对NFATc1的调控与之前报道的DYRK1A对NFATc2的调控相反,DYRK1A提高了 NFATc1的蛋白水平和转录活性,降低了 NFATc2的转录活性。基于分子之间相互作用而设计出的特异性DYRK1A抑制多肽药物,可以作为一种治疗GBM的潜在新型药物。