论文部分内容阅读
植物病原菌产生的激发子是一类重要的信号分子,能模仿植物与病原菌的信号交流,引起过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)和气孔关闭,诱发植物的抗病性。本研究采用病毒诱导基因沉默(virus inducing gene silencing,VIGS)技术克隆了本氏烟(Nicotiana benthamiana)中受不同来源激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的调控过敏性细胞死亡的基因,并对其中一个调控过敏性细胞死亡的基因NbALY916进行了系统的功能研究。以农杆菌Gv3101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有7000个单克隆的本氏烟cDNA文库,采用牙签刺伤法和注射接种法,从6000个克隆中筛选到35个受不同激发子诱导的调控过敏性细胞死亡的基因(片段)。对上述阳性克隆进行序列测定和分析,发现其中14个与已知的基因具有较高的同源性,其中克隆Nb14-4编码一个特异的ALY蛋白；克隆Nb14-56编码普通烟中的一种捕光叶绿素a/b结合蛋白；克隆Nb38(2)-59编码一个核糖核蛋白RNP-1；克隆Nb3-9和Nb4-26分别编码一个苹果酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶；Nb4-28编码普通烟中的14-3-3 d-2蛋白。还有21个克隆在公共数据库中没有同源基因,提示可能是因克隆到的片段过小或数据库中本氏烟EST序列不全造成的。上述结果表明,利用病毒表达载体建立cDNA文库,采用病毒诱导基因沉默技术可从烟草全基因组内克隆受不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,为揭示植物过敏性细胞死亡分子机制提供试验依据。从本氏烟cDNA文库中筛选到一个调控过敏性细胞死亡的基因NbALY916,该基因沉默能抑制Nep1诱导的HCD,减缓harpin诱导的HCD,但不影响INF1诱导的HCD；而本氏烟中其它的三个ALY基因(NbALY615、NbALY617和NbALY1693)分别沉默后不影响3种激发子诱导的HCD,表明NbALY916在调控激发子诱导的HCD过程中具有特异性。NbALY916基因沉默削弱了激发子Nep1和harpin诱发的H2O2积累、抑制了它们诱导的气孔关闭和保卫细胞中NO的积累,但是对激发子INF1信号途径却没有影响,同时不影响3种激发子诱导的保卫细胞内活性氧的积累。表明NbALY916在不同激发子诱导气孔关闭及NO和H2O2积累中作用存在差异。与此同时,NbALY916沉默能抑制激酶MAPKKKα过表达所诱导的过敏性细胞死亡,抑制转录因子WRKY2的表达,但不影响MAPKKKα、MEK2和WIPK基因的转录水平；而它在MAPKKKα、MEK2和WLPK基因沉默植株中的表达却受抑制。此外,NbALY916基因沉默还可抑制Nep1诱导的PR基因转录,进而影响植物抗病性。由此推测,NbALY916可能作用于MAPK级联途径的下游来介导激发子Nep1诱导的过敏性细胞死亡和抗病反应,而另外的两种激发子harpin和INF1可能通过激活其它不同的信号途径来进行信号传递。