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植物寄生线虫是植物侵染性病害的重要病原物之一，分布广泛，其寄主范围广，危害严重，而且受害植物更易受真菌和细菌侵染，成为诱发植物其他病害的重要原因之一.对于植物线虫的防治，历来以化学药剂为主，而且仍是目前防治中的一个重要措施，在防治有害生物和保障农业增产方面起了积极作用。但是化学药剂的长期大量使用产生“3R”等诸多问题，其应用日益受到限制。生物防治的研究为植物线虫的防治提供了一条安全、可靠的途径。其中，淡紫拟青霉[Paecilomyceslilacinus(Thom)Samson]对线虫寄生率高，寄主范围广，防治效果显著，被认为是最具前途的防治有害线虫的生防真菌之一。
淡紫拟青霉既是经济重要的病原真菌，也是研究微生物与植物寄生线虫相互作用的重要生物，从全基因组水平分析研究该菌关键基因的功能，可以加速对淡紫拟青霉生物学及其致病分子机制的认识，为培育持久抗病品种和制定植物寄生线虫持续管理的策略提供理论依据。为此，本研究利用农杆菌介导转化T-DNA插入技术，构建淡紫拟青霉T-DNA插入突变体库，并对部分突变体进行了分析，具体研究如下：
首先构建了含抗除草剂基因(bar)和绿色荧光蛋白GFP的淡紫拟青霉遗传转化表达载体。构建的方法为：在表达载体pCAMBIA1302的基础上构建适合于拟青霉遗传转化的表达载体，对pCAMBIA1302的选择标记基因及其启动子进行了改造，构建了两个载体pTBAR和pGBAR。构建的结果如下：通过PCR方法从pC30RG载体中扩增得到Trpc启动子，从pGAPZα-A载体中扩增得到Gap启动子，将适用于真菌表达的启动子Trpc、Gap分别替换pCAMBIA1302中靠近左边界位于选择标记潮霉素基因上游的Camv35S启动子；再根据设计的保守引物通过PCR方法从pBHt2载体中扩增获得bar基因替换选择标记潮霉素基因，构成载体pTBAR和pGBAR。
通过电击转化将两个表达载体分别导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3103中，成功转化了淡紫拟青霉，并对转化效率进行了优化，包括选择转化子的除草剂草甘膦铵盐原药(Glyphosateammonium)敏感性测定，抑制根癌农杆菌的抗生素头孢霉素(Cef)的剂量，诱导剂乙酰丁香酮(AS)及共培养时间和受体菌淡紫拟青霉浓度等的影响。多次转化结果表明：在AS加入量为.200μg/mL，P.LicinusE7孢子浓度为106个/mL的转化条件下，在根癌农杆菌生长浓度OD600为0.3-0.4左右，共培养时间为14小时时，在抗性筛选培养基上所出现的抗性转化子个数最多，每转化106个P.LicinusE7分生孢子可以得到约250个插入转化子。且转化子继代6代后，转化子仍保持稳定的抗性。从中随机选取抗性转化子30个进行bar基因的PCR检测，其中有11个扩增得到目的片段。通过荧光显微镜检测，阳性转化子可发出绿色荧光，证明含bar基因的T-DNA已插入淡紫拟青霉基因组中。
本实验共获得含bar基因的抗性转化子1453个，与出发菌株P.LE7对比转化子中绝大部分菌落型态与原始菌相似，只有少数转化子在菌落颜色、形态、生长速度等方面有不同程度差异：如菌落颜色明显加深且有轮状纹的T101.；白色突变体T629。而转化子的菌丝、分生孢子的形态及大小均没有发现明显的变化。随机抽取60株转化子进行毒力测定分析，研究发现3个疑似致病性减弱突变体，12个致病性增强突变体，其中有4株具有高毒性明显高于P.LilaciusE7，对线虫的校正致死率都超过60％，室内盆栽试验和小区试验都表现良好的生防效果。
农杆菌介导转化淡紫拟青霉体系的建立，为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础。