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背景含非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(Cytosine-phosphate-guanine dinucleotide,CpG)的寡核苷酸(Oligodeoxynucleotides,ODNs)作为Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)的配体,可直接激活浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid dendritic cells,pDCs)和B细胞,诱导体液免疫和细胞免疫。根据序列、结构和体外活性的不同,CpG ODNs主要分为A(D,CpG-A)、B(K,CpG-B)和C(CpG-C)三种类型。CpG-A ODNs以包含CpG的回文序列为核心,3?和5?端为硫代磷酸修饰的poly G尾,可刺激pDCs分泌大量的干扰素(Interferon,IFN)-α;CpG-B ODNs在全硫代磷酸修饰骨架中包含一个或多个CpG基序,无poly G尾,可刺激B细胞;CpG-C ODNs兼具CpG-A ODNs和CpG-B ODNs的特征,具有全硫代磷酸修饰的骨架,且3?端为包含CpG基序的回文序列,既可刺激pDCs分泌IFN-α,又可刺激B细胞,但CpG-C ODNs的免疫效应介于CpG-A ODNs和CpG-B ODNs之间。此外,CpG ODNs已被证实可刺激I型T细胞辅助细胞(Type-I helper T cells,Th1)偏向性免疫反应,促进抗原特异性抗体的产生和CD8~+T细胞的细胞毒性。在肿瘤微环境中,CpG ODNs可激活免疫系统,打破免疫抑制状态,从而抑制肿瘤生长。在临床前和临床研究中,三种类型CpG ODNs均显示出抗肿瘤活性。近年来,CpG ODNs联合其他药物,特别是免疫检查点抑制剂如程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1,PD-1)抑制剂有效治疗肿瘤而受到广泛关注。在临床前研究中,三种类型CpG ODNs与PD-1抑制剂联合均可协同抑制小鼠结肠癌、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌和膀胱癌等肿瘤模型。在临床研究中,只有CpG-A ODNs和CpG-C ODNs与PD-1抑制剂联合正在开展临床I/II期试验,无CpG-B ODNs与PD-1抑制剂联合的临床试验。然而,尚不清楚三种类型CpG ODNs作为单药及其与抗PD-1抗体联合的抗肿瘤作用的差异。因此,迫切需要比较三种类型CpG ODNs的免疫刺激活性和抗肿瘤效果,为肿瘤患者临床治疗给药方案的选择提供理论基础。方法我们选用典型的三种类型CpG ODNs:ODN 1585(CpG-A)、ODN 1826(CpG-B)和ODN 2395(CpG-C),利用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、流式细胞微珠阵列法(Cytometric bead array,CBA)和流式细胞术验证三种类型CpG ODNs对小鼠脾脏细胞细胞因子分泌、pDCs活化、B细胞活化和增殖的刺激作用。利用过表达小鼠TLR9的HEK-Blue?-mTLR9细胞及其阴性对照HEK-Blue?Null1细胞,验证三种类型CpG ODNs对小鼠TLR9-核因子(Nuclear factor,NF)-κB通路的刺激作用。通过RNA测序方法,在转录组水平上进一步比较三种类型CpG ODNs对pDCs和B细胞的刺激作用。然后,我们构建小鼠CT26皮下肿瘤模型,检测了不同剂量的三种类型CpG ODNs对小鼠CT26肿瘤的抑制作用,同时检测低剂量和高剂量CpG ODNs与抗PD-1抗体联合对小鼠CT26肿瘤的抑制作用。利用流式细胞术检测肿瘤微环境中多种免疫细胞表面PD-1配体PD-L1的表达情况及T细胞的比例和功能状态。最后,我们与合作单位共同设计合成了新的CpG-C ODNs—HP06T07,利用ELISA、CBA和流式细胞术验证HP06T07对小鼠脾脏细胞和人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)细胞因子分泌、B细胞活化和增殖的刺激作用。利用HEK-Blue?-mTLR9细胞和不表达TLR9的人单核细胞来源的树突状细胞(Monocyte-derived dendritic cells,MoDCs)研究HP06T07对TLR9的靶向性。利用小鼠CT26皮下肿瘤模型,检测HP06T07的抗肿瘤作用,明确HP06T07抗肿瘤作用的最佳给药剂量和给药方案。通过免疫组化方法,检测HP06T07对小鼠CT26肿瘤微环境中T细胞浸润的影响。结果三种类型CpG ODNs以不同的剂量依赖方式刺激小鼠IFN-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α和白细胞介素(Interleukin,IL)-6的分泌,其中CpG-B对IFN-α的刺激作用较弱,CpG-A对IL-6的刺激作用较弱。三种类型CpG ODNs对pDCs和B细胞活化的刺激作用相似,但在低浓度时CpG-C的作用介于CpG-A和CpG-B之间。CpG-C对B细胞增殖的刺激作用与CpG-B相似,对TLR9-NF-κB活化的刺激作用比CpG-B略强,而CpG-A对B细胞增殖和TLR9-NF-κB活化的刺激作用较弱,但在低浓度时CpG-C的作用也介于CpG-A和CpG-B之间。RNA测序结果显示,CpG-C对pDCs的刺激作用与CpG-A相似,而CpG-B可显著刺激CCL3、CXCL16、IL-10等与免疫功能相关基因的表达;此外,CpG-C对B细胞的刺激作用与CpG-B几乎完全相同。CpG-B和CpG-C在各自的最适剂量下具有相似的抗肿瘤作用,可显著抑制小鼠CT26肿瘤生长,而CpG-A对小鼠CT26肿瘤的抑制作用较弱。此外,与CpG-B相比,CpG-C联合抗PD-1抗体能更快速有效地发挥抗肿瘤作用,而CpG-A与抗PD-1抗体无协同抗肿瘤作用。我们发现,与CpG-A和CpG-C相比,CpG-B显著上调肿瘤微环境中多种免疫细胞表面PD-L1表达。同时,CpG ODNs及其联合抗PD-1抗体促进肿瘤微环境中CD8~+T细胞浸润,刺激T细胞表达IFN-γ,诱导CD44~+CD62L~-效应记忆性T细胞分化。基于CpG-C强大的免疫刺激活性和抗肿瘤作用,我们设计合成了HP06T07。与ODN 2395刺激组相比,HP06T07显著诱导小鼠脾脏细胞和人PBMCs细胞因子分泌,促进B细胞活化和增殖。瘤内注射HP06T07可显著抑制小鼠CT26肿瘤生长,延长小鼠生存期,且HP06T07每隔2天连续给药9次的抗肿瘤效果最佳。免疫组化结果显示,HP06T07可促进肿瘤微环境中T细胞的浸润。结论1.不同种类的CpG ODNs具有不同的最适浓度和剂量依赖方式,在各自的最适剂量时,CpG-C对小鼠pDCs的刺激作用与CpG-A相似,对小鼠B细胞的刺激作用几乎与CpG-B完全相同。2.CpG-B和CpG-C均可显著抑制小鼠CT26结肠癌,且两者与抗PD-1抗体联合均具有协同抗肿瘤作用,但CpG-C联合抗PD-1抗体能更快速有效地抑制小鼠CT26结肠癌;CpG-B和CpG-C与抗PD-1抗体联合均可促进效应记忆性T细胞浸润。3.HP06T07作为CpG-C ODNs可显著刺激小鼠脾脏细胞和人PBMCs细胞因子分泌,诱导人和小鼠B细胞的活化和增殖,抑制小鼠CT26结肠癌肿瘤生长。