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目的:1.明确铁死亡是否参与糖尿病性骨质疏松(DOP)的发病机制;2.明确黄芩素在体内抑制铁死亡防治DOP的作用;3.基于SLC7A11/GPX4轴探讨黄芩素在体外抑制BMSCs铁死亡的作用机制。方法:1.动物实验研究(1)铁死亡在DOP发病中的作用Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为三组:基线组,对照组和模型组。模型组大鼠给予高脂饲料喂养4周后,给予链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(30mg/Kg体重)单次腹腔注射造模,建立2型糖尿病模型,测量大鼠体重、进水量和摄食量、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),8周后取材。检测指标:(1)体重、进水量和摄食量l比较对照组和模型组大鼠的体重、进水量和摄食量。(2)血糖及糖化血红蛋白血糖仪检测大鼠尾静脉多个时间点FBG,以及血糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb Ac1)水平。(3)腰椎骨量取大鼠腰椎腰1-3(L1-3),用双能X线吸收法进行骨密度(bone mineral density,BMD)检测。(4)腰椎骨组织形态大鼠L1-3椎体BMD测定后,分离L2椎体,进行苏木素-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色,观察组织形态学改变。(5)腰椎骨微细结构大鼠L1-3椎体BMD测定后,分离L3椎体,用micro-CT进行骨微细结构扫描,获取相关参数。(6)骨生物力学大鼠L1-3椎体BMD测定后,分离L1椎体,用万能材料试验机进行压缩试验;取大鼠股骨用万能材料试验机进行三点弯曲试验。分别获取相关参数。(7)氧化应激水平和铁离子水平大鼠血液离心获取血清,测定血清总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,t SOD)活性;取大鼠腰椎骨组织,研磨后裂解获取组织裂解样品;分别用试剂盒检测组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)和总铁离子水平。(8)铁死亡相关蛋白表达取大鼠冻存腰椎骨组织,研磨后裂解获取总蛋白,Western-blot检测COX2、VDAC2、FTH1、SLC7A11、GPX4蛋白的表达水平。(2)黄芩素对大鼠DOP的防治作用SD大鼠随机分为三组:空白对照组,模型组和黄芩素组。模型组和黄芩素组给予高脂饲料喂养4周后,给予STZ(30mg/Kg体重)单次腹腔注射造模,建立2型糖尿病模型。两组分别再分为2部分用于预防实验和治疗实验。(1)黄芩素对血糖的影响检测大鼠尾静脉FBG;进行口服糖耐量测试(oral glucose tolerance test,OGTT),即空腹(0h)、0.5h、1h和2h血糖值;ELISA法检测血清GHb Ac1水平。(2)黄芩素对骨量的影响取大鼠L1-3,用双能X线吸收法进行BMD检测。(3)黄芩素对骨生物力学的影响大鼠L1-3椎体BMD测定后,分离L1椎体,用万能材料试验机进行压缩试验;取大鼠股骨用万能材料试验机进行三点弯曲试验。分别获取相关参数。(4)黄芩素对骨微细结构的影响大鼠L1-3椎体BMD测定后,分离L3椎体,用micro-CT进行骨微细结构扫描,重建分析,获取相关参数。(5)黄芩素对骨组织形态的影响大鼠L1-3椎体BMD测定后,分离L2椎体,进行HE染色,观察组织形态学改变。(6)黄芩素对氧化应激的影响血液离心后获取血清,测定血清总t SOD活性;取大鼠腰椎骨组织,研磨后裂解获取组织裂解样品,用试剂盒检测组织MDA水平。(7)黄芩素对成破骨因子的影响ELISA法检测血清OPG、RAKNL、TRAP5b水平。(8)黄芩素对SLC7A11/GPX4轴蛋白表达的影响取大鼠冻存腰椎骨组织,研磨后裂解获取总蛋白,Western-blot检测COX2、SLC7A11、GPX4蛋白的表达水平。2.细胞实验研究从3-4周龄SD大鼠股骨或胫骨提取骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cell,BMSCs),培养传代,取P3-5进行实验。(1)黄芩素和乙酰半胱氨酸对BMSCs增殖的影响BMSCs种于96孔板,CCK-8法检测不同浓度黄芩素、乙酰半胱氨酸(NAC)下BMSCs在1、3、5、7天的增殖情况。(2)Erastin诱导BMSCs脂质过氧化和铁死亡的作用检测不同浓度Erastin下BMSCs产生MDA的水平;CCK-8检测不同浓度Erastin下BMSCs存活率(铁死亡情况)。(3)黄芩素对Erastin下BMSCs脂质过氧化和细胞内铁离子水平的影响检测黄芩素干预下BMSCs MDA和细胞内总铁离子水平。(4)黄芩素对Erastin下BMSCs存活率的影响CCK-8检测黄芩素干预下BMSCs存活率(铁死亡)。(5)黄芩素对Erastin下BMSCs增殖的影响CCK-8检测黄芩素干预下BMSCs在1、3、5天的增殖情况。(6)黄芩素对Erastin下BMSCs成骨分化的影响ALP染色观察黄芩素干预下BMSCs成骨分化的情况。(7)黄芩素对SLC7A11/GPX4轴蛋白表达的影响Western-blot检测SLC7A11/GPX4轴表达。结果:1.动物实验研究(1)铁死亡在DOP中的作用(1)大鼠STZ造模后,模型组多个时间点FBG均显著高于对照组(P<0.01或P<0.001),体重显著低于对照组(P<0.001)。(2)模型组腰椎BMD较对照组显著降低(P<0.01)。(3)模型组腰椎骨组织形态发生显著改变,骨小梁数目减少、骨小梁厚度变薄,骨髓内脂肪显著增加。(4)模型组腰椎相对骨体积(BV/TV)、骨小梁厚度、骨小梁数量显著减小(分别P<0.05、P<0.01、P<0.05)。(5)与基线组比较,对照组腰椎最大载荷、断裂载荷显著提升(均P<0.01);与对照组比较,模型组腰椎最大载荷、断裂载荷、弹性模量有较明显的降低趋势,股骨最大载荷显著降低(P<0.05)。(6)模型组血清OPG水平显著降低(P<0.05),RANKL、OPG/RANKL有轻微降低趋势;(7)模型组血清t SOD活性显著降低(P<0.05);骨组织MDA和总铁离子水平显著升高(均P<0.05);(8)模型组骨组织铁死亡相关蛋白COX2表达显著上调(P<0.01),SLC7A11、GPX4、FTH1显著下调(分别P<0.05、P<0.05、P<0.01)。(2)黄芩素抑制铁死亡预防DOP(1)STZ造模后,模型组和黄芩素组FBG显著高于空白对照组(均P<0.001),模型组和黄芩素组差异无显著意义。(2)预防实验中:模型组腰椎BMD较空白对照组显著降低(P<0.01),黄芩素组显著高于模型组(P<0.05)。治疗实验中:模型组BMD显著低于空的对照组(P<0.05),黄芩素组较空白对照组降低无统计学意义。(3)预防实验中:模型组腰椎最大载荷显著低于空白对照组(P<0.01)、压缩位移显著高于空白对照组(P<0.01),黄芩素组腰椎最大载荷较空白对照组降低但无统计学意义。模型组和黄芩素组股骨最大应力较空白对照组显著下降(分别P<0.001和P<0.05),黄芩素组股骨最大应力较模型组显著增加(P<0.05)。治疗实验中:模型组腰椎最大载荷、断裂载荷均显著降低(分别P<0.05和P<0.05),黄芩素组较模型组均无显著差异。模型组股骨最大载荷较空白对照组显著降低(P<0.05)。(4)预防实验中:模型组腰椎BV/TV、Tb.N、Tb.Th较空白对照组显著降低(分别P<0.05、P<0.01、P<0.01)、Tb.Sp显著增加(P<0.01),与模型组比较黄芩素组Tb.N显著增加(P<0.05)、Tb.Sp显著降低(P<0.05)。治疗实验中:模型组腰椎Tb.Th较空白对照组显著降低(P<0.01)、Tb.Sp显著增加(P<0.01),黄芩素组较模型组无显著差异。(5)预防实验中:模型组腰椎骨小梁较空白对照组显著变细、黄芩素组骨小梁较模型组显著变粗。治疗实验中:模型组腰椎骨小梁较空白对照组显著变细、骨髓脂肪增多,黄芩素组骨组织形态较模型组无显著差别。(6)预防实验模型组、黄芩素组大鼠血清GHb Ac1较空白对照组显著升高(P<0.05和P<0.01)。(7)预防实验模型组大鼠血清t SOD活性较空白对照组显著降低(P<0.05),黄芩素组t SOD较模型组显著提升(P<0.001);模型组骨组织MDA水平较空白对照组显著增加(P<0.01),黄芩素组MDA水平较模型组有明显降低趋势(P=0.054)。(8)预防实验模型组血清OPG较空白对照组显著降低(P<0.01),黄芩素组较模型组有轻微升高趋势。模型组RANKL较空白对照组有降低趋势,黄芩素组较模型组无显著差异。模型组TRAP5b较空白对照组有较大升高趋势,黄芩素组较模型组有较大降低趋势。(9)预防实验模型组COX2表达较空白对照组显著上调(P<0.01),黄芩素组较模型组有明显下调趋势;模型组GPX4较空白对照组显著下调(P<0.01),黄芩素组较模型组显著上调(P<0.01)。2.细胞实验研究(1)1、2、4μM黄芩素7天内对BMSCs增殖无影响,Day5时,在8、16μM浓度下,黄芩素可显著抑制BMSCs增殖(分别P<0.01和P<0.001);Day7时,在16μM浓度下,黄芩素可显著抑制BMSCs增殖(P<0.05)。1、2m M NAC在7天内对BMSCs增殖无影响;Day1时,8m M NAC可显著促进BMSCs增殖(P<0.01),16m M可显著抑制BMSCs增殖(P<0.01);Day5时,8、16m M NAC均可显著抑制BMSCs增殖(分别P<0.05和P<0.001);Day7时,4、8、16m M NAC均可显著抑制BMSCs增殖(分别P<0.05、P<0.01、P<0.001)。(2)Erastin 10、20、30、40μM下,BMSCs MDA水平显著增加(分别P<0.05、P<0.001、P<0.0001、P<0.0001),20、30、40μM下细胞存活率显著降低(分别P<0.05、P<0.05和P<0.01)。(3)Erastin(20μM)下,黄芩素(4μM)和NAC(2m M)可显著降低BMSCs MDA水平(均P<0.001)。(4)Erastin(20μM)下,4、8μM黄芩素使BMSCs存活率显著增加(分别P<0.05和P<0.001)。(5)Erastin(10μM)下,黄芩素(4μM)可显著改善BMSCs Day3、Day5的BMSCs增殖(分别P<0.05、P<0.01)。(6)Erastin(3μM)可显著抑制BMSCs成骨分化,黄芩素可一定程度改善Erastin下BMSCs成骨分化。(7)Erastin(10μM)显著下调SLC7A11和GPX4表达(分别P<0.01和P<0.01),黄芩素可显著上调Erastin干预下SLC7A11和GPX4的表达(分别P<0.05和P<0.001)。结论:体内研究发现:铁死亡参与DOP的发病机制;黄芩素可以有效预防DOP的发生,其机制与上调SLC7A11/GPX4轴抑制铁死亡有关。体外实验研究发现:黄芩素可以上调SLC7A11/GPX4轴抑制BMSCs铁死亡,促进BMSCs增殖和成骨分化。因此,黄芩素可预防DOP,其机制与上调SLC7A11/GPX4轴抑制BMSCs铁死亡有关。