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目的:垂体腺苷酸环化酶激活多肽（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）的生物学功能由三个B类G蛋白偶联受体介导:VPAC1-R、VPAC2-R和PAC1-R,其中VPAC1-R和VPAC2-R是血管活性肠肽（Vasoactivei Intestinal peptide,VIP）和PACAP的共同受体,PAC1-R是PACAP的偏好性受体。N端胞外域（N-terminal extracellular domain,EC1）在配体的识别和结合中具有重要的作用,是激动剂与小分子调节剂的体外筛选的工具。本文通过基因工程的原理和技术实现VPAC1-R和VPAC2-R的N端胞外域（VPAC1-EC1和VPAC2-EC1）重组蛋白的制备,并在体外水平采用等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）探索其与强力霉素（Doxycycline,DOX）/米诺环素（Minocycline,MINO）及多肽PACAP（28-38）与穿膜肽TAT的结合;我们还检测了针对PAC1-R的N端胞外域筛选出的小分子别构调节剂SPAM1与PACAP三个受体的N端胞外域的结合。以受体N端胞外域重组蛋白的制备为基础的体外结合实验为激动剂与小分子调节剂的体外筛选提供实验基础。方法:将VPAC1-EC1和VPAC2-EC1基因序列通过密码子优化合成,添加六个组氨酸（6×His）纯化标签,克隆到表达载体,构建表达质粒,获得工程菌pET30a-6His-VPAC1-EC1-BL21（DE3）和pET30a-VPAC2-EC1-BL21（DE3）。对发酵条件进行摸索,并通过包涵体变性复性及Ni-NTA亲和层析柱纯化获得两个重组蛋白VPAC1-EC1和VPAC2-EC1,经过Western Blot鉴定后检测重组蛋白VPAC1-EC1和VPAC2-EC1采用ITC检测分别与VIP和PACPA27的结合,以确定它们的生物学活性。制备PAC1-R的N端胞外域（PAC1-EC1）重组蛋白,采用ITC检测完成以下研究:1)测定DOX/MINO与PAC1-EC1/VAPC（1/2）-EC1的亲和力;2)检测靶向PAC1-R的N端胞外域的小分子别构调节剂SPAM1与PACAP三个受体的N端胞外域的结合;3)检测PACAP（28-38）/TAT对PAC1-EC1的竞争性结合。结果:本文成功构建了工程菌pET30a-VPAC1-EC1-BL21（DE3）和pET30a-VPAC2-EC1-BL21（DE3）;经诱导工程菌表达蛋白为包涵体蛋白,通过对发酵条件的优化,包涵体经变性、复性Ni-NTA亲和层析柱纯化,重组蛋白VPAC1-EC1的得率为93±2mg可溶性蛋白/L发酵液和VPAC2-EC1为78±5mg可溶性蛋白/L发酵液。ITC测定显示,VIP与VPAC1-EC1的结合常数Ka值为3.48E5±1.88E5M-1;PACPA27与VPAC2-EC1的Ka值5.88E6±3.06E6M-1,说明重组蛋白VPAC1-EC1和VPAC2-EC1具有生物活性。1)在与DOX/MINO的结合实验中,VPAC1-EC1与DOX的结合常数Ka值为2.58E5±1.49E5M-1,与MINO的结合常数Ka值为1.93E4±1.89E4M-1;VPAC2-EC1与MINO反应无法拟合曲线;与DOX的结合常数Ka值为2.86E6±7.99E5M-1。结果说明VPAC1-R的N端胞外域与DOX/MINO有结合现象,VPAC2-R的N端胞外域与DOX亲和力较强。2)ITC实验验证了SPAM1与PAC1-EC1结合,结合常数Ka值为2.59E6±1.90E6M-1;SPAM1与VPAC1-EC1没有结合;与VPAC2-EC1存在结合,Ka值为3.09E5±2.87E5M-1。3)ITC检测PACAP（28-38）和TAT与PAC1-EC1的亲和力,Ka值分别为5.03E5±1.59E5M-1和6.35E5±8.39E4M-1,并通过竞争性结合实验验证了PACAP（28-38）和TAT在PAC1-R的N端胞外域上的结合位点相同。结论:在成功实现VPAC1-R和VPAC2-R的N端胞外域重组蛋白制备的基础上,首次利用ITC检测小分子包括DOX/MINO/SPAM1分别与VPAC1-EC1/VPAC2-EC1/PAC1-EC1的结合。首次利用ITC检测PACAP（28-38）与穿膜肽TAT靶向PAC1-R的N端胞外域的竞争结合,以上研究为靶向PACAP三个受体N端胞外域的激动剂或调节剂的体外筛选与鉴定奠定实验基础。