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维生素D<,2>是麦角固醇经紫外线照射转变来的,麦角固醇存在于真菌的细胞膜中,本文对酵母发酵产麦角固醇作了详细研究,探讨了麦角固醇光化学合成维生素D2的两种转化工艺。
本文首先对定量分析麦角固醇的方法进行了研究,比较分析了紫外分光光度法、乙酸酐显色法、高效液相色谱法在选育麦角固醇高产菌株方面的优劣,确定HPLC检测麦角固醇含量的各项参数:色谱柱Shim-pack CLC-SIL,流动相(V/V),甲醇∶水=97∶3,流速1.5mL/min,进样量10μ L,紫外检测波长282nm。虽然高效液相色谱法结果准确,但是结合实验室条件确定紫外分光光度法为麦角固醇的测定方法。
在“皂化一萃取一紫外检测”法中,对于10mL 发酵液(约含生物量0.1g左右)最佳的皂化及测定条件是 KOH30﹪(W/V),无水乙醇40﹪(V/V),50mL乙醚作萃取溶剂,最佳萃取时间为10min,在282nm处测紫外吸收值。
从10个不同种属的酵母菌中,筛选得到一株麦角固醇含量和生物量都较高的菌株酿酒酵母QYW-2(Saccharomyces cerevisiae QYW-2),该菌株培养14h左右即结束菌体生长的指数期,碳源利用较广,如蔗糖、葡萄糖等都可作为适宜的碳源;在氮源方面,以有机氮源为最佳,其中蛋白胨作氮源时麦角固醇产量最高。
运用单因素实验和正交实验法优化出适合工业生产的发酵培养基组成,酿酒酵母QYW-2发酵产麦角固醇的最佳培养基为(/L):糖蜜180mL,玉米浆100mL,(NH<,4>)<,2>SO<,4> 5g,MgSO<,4> O.1g,K<,2>HPO<,4> 0.8g,MgSO<,4>对菌种产麦角固醇及菌体生长有显著的促进作用;少量添加的ZnSO<,4>·7H<,2>O有利于菌体生长,但对产麦角固醇有一定的抑制作用,FeSO<,4>·7H<,2>O、CuSO<,4>·5H<,2>O不利于酿酒酵母QYW-2产麦角固醇。
酿酒酵母QYW-2在最佳种子培养基中培养14h,按10﹪(V/V)接种量接种于最佳发酵培养基中,最适发酵温度30℃,摇床转速200r/min,发酵最适起始pH5.5,最佳发酵周期36h,在较佳培养基及培养条件下,酿酒酵母QYW-2麦角固醇含量达到3.19﹪,生物量达到14.4g/L,发酵液麦角固醇产量可达460mg/L。
麦角固醇溶液转化成维生素D2的最佳光照时间为25min,高效液相色谱测定维生素D<,2>的条件为色谱柱VP-ODS,流动相(V/V),甲醇∶乙腈=1∶1,流速1.0mL/min,进样量20μL,紫外检测波长265nm。
发酵培养后的酵母菌体直接在紫外灯下照射,麦角固醇可转变成维生素D<,2>,此种酵母作为提供维生素D<,2>来源的饲料添加剂,比先提取麦角固醇再照射转变成维生素D<,2>的方法省时、省力、更方便。