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枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)(2n=2x=34)属于蔷薇科枇杷属植物,是我国南方的主要果树之一,其中枇杷非整倍体对其遗传育种研究具有重要意义。在生物体中,不同基因剂量之间存在微妙而敏感的平衡。通常,整倍体不会改变染色体类型或基因的相对剂量。而非整倍体染色体之间的相对剂量是不平衡。非整倍体通常具有特定于分子核型的新表型。当前,检测植物非整倍体分子核型的技术较少,部分现有的技术成本较高,程序也较为繁琐。因此,建立一种快速、简便的枇杷非整倍体分子核型检测技术十分必要。为此,基于非整倍体染色体之间相对剂量的不平衡,本研究开发了一种新方法用于枇杷非整倍体分子核型的检测,命名为“基于SSR分子标记和qPCR组合(SSR-qPCR)的枇杷非整倍体检测方法”。该方法在三倍体枇杷后代中进行了应用,为枇杷非整倍体的快速检测和分子核型的构建提供了技术支撑。主要试验结果如下:1、qPCR引物的筛选(1)以23个不同倍性枇杷株系(品种)(包括22个整倍体和1个非整倍体H39)的基因组DNA为模板,对209对SSR引物进行PCR扩增,筛出无多态性且扩增稳定的SSR引物17对,该17对引物分别位于枇杷的17个连锁群(根据一个已知的枇杷高密度遗传连锁图谱)。(2)将17对SSR引物进行qPCR检测,发现17对SSR引物在22个整倍体枇杷材料中扩增效率相同,溶解曲线均为单一峰,CT值在15至25之间,均是特异性SSR引物,可用于本次试验研究。2、基于SSR-qPCR枇杷非整倍体分子核型分析体系的初步建立以前述筛选的17对SSR引物,利用qPCR对3个整倍体枇杷株系(‘软条白沙’(2x)、‘无核国玉’(3x)、H424(4x))和1个非整倍体枇杷株系H39(2n=39)的基因组DNA进行扩增。在qPCR扩增的指数增长阶段(Ct值在16至24之间)检测PCR扩增产物的量(ΔRn值),在3个整倍体枇杷株系中17个SSR标记的ΔRn比值相近,而H39在5个连锁群的ΔRn值均发生变化。H39在LG3、LG8、LG10、LG16、LG17的ΔRn均值比整倍体高出约41.8%。表明H39在LG3、LG8、LG10、LG16、LG17上分别比二倍体‘软条白沙’多一条染色体。H39的SSR-qPCR结果与染色体制片结果一致,均表明H39有39条染色体。可见,基于该17对SSR引物进行qPCR扩增能检测H39的分子核型。3、其他材料的分子核型鉴定三倍体株系能产生一些非整倍体后代,故本研究以三倍体枇杷株系(品种)的后代为材料,对上述方法进行验证和改进。(1)染色体计数通过染色体制片对部分三倍体自然结果的后代和三倍体与二倍体杂交的后代进行染色体计数。材料主要为:Q24(3x)ב华白1号’(2x)的9个杂交后代、三倍体枇杷A313的7个开放授粉后代和三倍体枇杷A322的9个开放授粉后代。结果显示:这些三倍体后代中22个为非整倍体,3个为四倍体。(2)SSR-qPCR检测(1)Q24(3x)ב华白1号’(2x)的后代为了量化SSR-qPCR准确率,使用SSR-qPCR对Q24ב华白1号’的9个杂交后代进行非整倍化检测,以4个整倍体枇杷株系‘华白1号’(2x)、‘常白1号’(2x)、Q24(3x)、‘华玉无核1号’(3x)为对照。对照材料的ΔRn值在0.84-1.08之间,8个杂交后代的SSR-qPCR结果与染色体制片结果一致,SSR-qPCR检测准确率为88.9%。在枇杷的17个连锁群中均发现三体,8个杂交后代的三体主要分布于LG1,LG2,LG7,LG10,LG13,LG14。(2)三倍体枇杷株系A313、A322的开放授粉后代使用SSR-qPCR对三倍体枇杷株系A313、A322的16个开放授粉后代进行非整倍化检测,以‘大五星’(2x)、A313(3x),A322(3x)等22个已知整倍体枇杷材料为对照。对照材料的ΔRn值在0.81-1.15之间,将SSR-qPCR检测结果与染色体制片结果进行比较,发现SSR-qPCR的检测准确率为62.5%。共检出2个四倍体,3个三体材料和5个五体材料。3个三体材料的三体主要分布于LG1、LG4、LG7、LG9、LG10、LG11、LG12、LG14。5个五体材料的五体主要分布于LG1、LG3、LG4、LG5、LG7、LG8、LG9、LG12、LG13、LG14、LG17。综上所述,本研究筛选出位于枇杷17个连锁群的17个特异性非多态SSR标记,并重新设计了其中6个SSR标记的引物,可用于检测枇杷染色体非整倍性。利用SSR-qPCR对三倍体枇杷的杂交后代和开放授粉后代分别进行分子核型检测,与染色体制片结果比较,SSR-qPCR检测准确率分别为88.9%和62.5%。由此可见,SSR-qPCR可用于建立枇杷非整倍体的完整分子核型分析体系,是植物非整倍性检测的新方法,但准确性有待提高,这可能与SSR标记的多态性有关,后续需继续筛选非多态性分子标记以对该方法进行改良。