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[研究背景和目的]肿瘤具有异质性,主要表现在肿瘤细胞生物学行为、病理学特征以及对化疗药物敏感性的不同,最终产生耐药的肿瘤细胞克隆出现,使得部分肿瘤细胞获得耐药性,这是导致一些肿瘤根治术后化疗仍然发生复发和转移的关键因素。目前认为,肿瘤微环境(tumor micro environment, TME)在介导肿瘤细胞获得耐药性和抵抗细胞凋亡等方面发挥了重要作用,而TME中特殊的生态位可能为肿瘤细胞克隆亚群提供一个“避难所”,为肿瘤细胞提供了一种生存优势。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)不仅在肿瘤细胞侵袭和转移过程中起关键作用,还与肿瘤细胞耐药性密切相关,但其机制尚不清楚。中期因子(midkine, MK)是一种糖胺聚糖结合分子,作为TME中特有的一个细胞因子,可能在调控肿瘤细胞获得耐药性方面发挥重要作用。本文研究MK诱导结直肠癌细胞对化疗药物耐受作用的影响,探讨MK诱导肠癌细胞发生EMT促进化疗耐药的分子机制,检测结直肠癌组织表达MK及其下游靶蛋白情况,分析其临床意义。[方法]1、中期因子诱导结直肠癌细胞耐受化疗药物的体外实验研究(1)MTT法分别检测：5-FU、L-OHP、CPT-11和索拉菲尼对肠癌细胞SW480和HCT116的生长抑制率,计算各种化疗药物对肠癌细胞的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration, IC50)。(2)MTT法分别检测5-FU、L-OHP、CPT-11和索拉菲尼在MK预处理或未处理下对肠癌细胞SW480和HCT116的生长抑制率,计算出各种化疗药物不同组IC50。(3)抑制试验：IKKa抑制剂预处理肠癌细胞SW480和HCT116,采用MTT法检测MK对各种化疗药物(IC50)作用下肠癌细胞的存活率。2、中期因子诱导肠癌细胞上皮间质转化促进化疗耐药信号转导机制的体外研究(1)显微镜下观察MK处理和未处理的肠癌细胞SW480和HCT116形态学变化。(2) Western blot检测MK处理和未处理的肠癌细胞SW480和HCT116中EMT标志物、ERK1/2、NF-κB (P65)、Bcl-2和P-gp表达变化。(3) lmmunofluorescence检测MK处理和未处理的肠癌细胞SW480和HCT116中EMT标志物和NF-κB (P65)表达及分布情况。(4)抑制试验：分别应用ERK抑制剂或IKKα抑制剂预处理肠癌细胞,采用Western blot检测EMT标志物、ERK1/2、NF-κB (P65)、Bcl-2和P-gp表达变化；immunofluorescence检测EMT标志物和NF-κB (P65)表达及分布情况。3、结直肠癌组织MK、NF-κB (P65)和P-糖蛋白表达及其临床意义研究。(1)免疫组织化学检测肠癌组织及其配对癌旁组织中MK、NF-κB (P65)和P-gp的表达情况。(2) Spearman方法分析结直肠癌组织中MK与NF-kB (P65)及P-gp表达的相关性。(3) Kaplan-Meier方法分析结直肠癌组织中MK和NF-κB (P65)表达与结直肠癌患者生存预后关系。[结果]1、MTT法检测结果显示,在MK处理或未处理情况下,5-FU对SW480细胞IC50为(3.50±0.17) μg/mL vs.(7.92±0.21) μg/mL, HCT116细胞IC50为(3.20±0.15) μg/mL vs.(6.80±0.19) μg/mL,(P<0.01); CPT-11对SW480细胞IC50为(14.24±0.22) μM vs.(28.58±0.26) μM, HCT116细胞IC50为(20.67±0.26) μM vs.(46.72±0.31)μM,(P<0.01); L-OHP)对SW480细胞IC50为(0.86±0.09) μM vs.(0.92±0.I3)μM, HCT116细胞IC50为(0.93±0.12) μM vs.(0.98±0.18) uM,(P>0.05);索拉菲尼对SW480细胞IC50为(4.85±0.19) μM vs.(5.12±0.23) μM, HCT116细胞IC50为(5.40±0.16) μM vs.(5.87±0.17) μM,(P>0.05)。2、IKKα抑制剂可逆转MK诱导的肠癌细胞对5-FU和CPT-11的耐药作用。在IKKα抑制剂预处理或未处理下,MK+5-FU (IC50)组SW480细胞存活率为78.4±5.7%, Bay11-7082+MK+5-FU (IC50)组SW480细胞存活率为14.8±1.8%; MK+CPT-11(IC50)组SW480细胞存活率为83±5.6%, Bay11-7082+MK+CPT-l1(IC50)组SW480细胞存活率为38.0±3.7%; MK+5-FU (IC50)组HCT116细胞存活率为76.3±6.5%,Bay11-7082+MK+5-FU (IC50)组的HCT116细胞存活率为22.3±4.6%; MK+CPT-11(IC50)组HCT116细胞存活率为78.5±7.1%, Bay11-7082+MK+CPT-11(IC50)组HCT116细胞存活率为47.3±7.6%。IKKα抑制剂预处理与未处理之间的差异具有统计学差异(**P<0.01)。3、MK诱导肠癌细胞上皮间质转化。在MK处理下,肠癌细胞SW480和HCT116形态均由规整排列的多角形或鹅卵石样向梭形或长条形改变,Werstern bolt和immunofluorescence检测发现E-cad蛋白表达下调,vimentin和(3-catenin蛋白表达上调。Bay11-7082预处理后发现细胞形态学无明显变化,E-cad表达上调,vimentin和P-catenin蛋白蛋白下调。4、MK激活ERK1/2、NF-κB信号通路使NF-κB (P65)转移到细胞核内,介导EMT发生,并上调Bcl-2及P-gp表达。MK处理下,肠癌细胞SW480和HCT116中P-ERKl/2、 NF-κB (P65)、Bcl-2及P-gp蛋白表达上调,NF-κB (P65)主要分布在细胞核内；PD98059预处理后P-ERK1/2、NF-κB (P65)、Bcl-2及P-gp蛋白表达下调；Bay11-7082处理下,P-ERK1/2无明显变化,NF-κB (P65)> Bcl-2及P-gp蛋白表达下调,NF-κB (P65)主要分布在胞质中。5、结直肠癌组织中MK、NF-κB (P65)及P-gp蛋白表达的阳性率分别为68.5%(χ2=80.821, P=0.000),61.9%(χ2=81.612, P=0.000)及63.5%(χ2=78.906,P=0.000)；MK与NF-κB (P65)表达呈正相关(r=0.631,P=0.000),MK与P-gp表达呈正相关(r=0.537,P=0.000)：MK或NF-κB (P65)表达阴性的结直肠癌患者术后平均总生存期分别为90.0月和92.7月,而表达阳性的结直肠癌患者术后平均总生存期分别为76.2月和76.5月。[结论]MK能诱导肠癌细胞发生、EMT和耐受化疗药物,其机制可能是MK通过激活ERK1/2/-NF-KB (P65)信号通路使NF-κB (P65)转入细胞核内与靶基因结合,促进靶基因的转录合成,介导EMT发生,并.上调Bcl-2和P-gp蛋白表达,进而促进肠癌细胞获得化疗耐药性。结直肠癌高表达MK、NF-κB (P65)和P-gp蛋白,三者之间表达呈正相关性。MK和NF-κB (P65)高表达的结直肠癌患者总生存时间低,预后差。因此,MK及NF-κB(P65)可作为结直肠癌化疗耐受及预后不良的预测指标,而MK及其ERK1/2/-NF-κB(P65)信号通路可作为结直肠癌潜在的治疗靶点。