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心血管病是我国居民疾病死亡的首要原因,患病基数及死亡人数多年以来一直处于高位,给我国的医疗卫生系统带来了繁重的负担。近年来,心血管领域的技术手段发展迅速,众多以前只有在顶尖医院才能开展的治疗手段已经成为大部分医院能够开展的常规治疗方式,给广大患者带来了极大的益处。但是由于我国国土辽阔,部分地域偏远地区的患者仍然可能无法在较短时间内获得相应的治疗,给其预后带来不利影响,因此,有必要从血管保护的角度考虑新的更为全面的防治策略。血管内皮细胞是所有心血管疾病所共同拥有的作用靶点,内皮功能障碍是大部分心血管病发病的启动因子和病理机制,在内皮细胞损伤时可释放多种生物活性物质,识别这些物质有助于为心血管病治疗提供新的思路。多肽是一类小分子活性物质,在心血管领域的研究已经取得了很好的成果,某些多肽可能具有潜在的血管内皮保护作用。采用多肽组学技术直接分析血管内皮细胞受损时分泌的多肽,有望在蛋白质多肽水平上探索血管内皮损伤的发病及保护机制,寻找潜在的干预靶点,为心血管病的防治开辟新视野。本研究通过构建血管内皮细胞损伤模型,应用多肽组学方法分析内皮细胞受损后所释放的多肽,筛选其中可能具有血管保护作用的多肽并进行功能研究,以探索心血管病领域潜在的新型生物标志物和治疗靶点。第一部分 血管内皮细胞损伤的多肽组学分析目的:使用血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）构建血管内皮细胞损伤模型,应用多肽组学的方法解析血管内皮细胞损伤的肽谱,筛选其中差异高表达且功能未知的多肽。方法:首先,人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）在内皮细胞培养基中培养,将不同浓度的Ang Ⅱ加入其中,并观察不同的处理时间,明确使用Ang Ⅱ的最适宜浓度和最适宜时间,以此建立稳定的血管内皮细胞损伤模型。然后,收集上述培养体系的上清液,对其中差异表达的多肽采用液相色谱串联质谱（Liquid chromatography tandem-mass spectrometry,LC-MS/MS）技术进行鉴定,并进行生物信息学分析。结果:1.应用0.1μM浓度Ang Ⅱ组的HUVEC细胞活力（0.97±0.04）与对照组（1.00±0.04）比较无差异（p＞0.05）;应用0.5μM、1μM、5μM利10μM 四种不同浓度Ang Ⅱ组的HUVEC细胞活力分别为（0.81±0.04）、（0.55±0.06）、（0.36±0.06）和（0.21±0.02）,较对照组有不同程度的下降（p＜0.05 或 0.001）,其中1μM 浓度下降约 45.2%（p＜0.001）。2.应用1μM浓度Ang Ⅱ处理6小时组的HUVEC细胞活力（0.96±0.06）与对照组（1.00±0.04）比较无差异（p＞0.05）;应用1μM浓度Ang Ⅱ处理12、24和36小时组的HUVEC细胞活力分别为（0.77±0.08）、（0.55±0.05）和（0.28±0.06）,较对照组明显下降（p＜0.05或0.001）,其中应用1μM浓度的Ang Ⅱ处理24小时组细胞活力下降44.6%（p＜0.001）。以1μM浓度Ang Ⅱ处理24小时为基础建立血管内皮细胞损伤模型。3.采用LC-MS/MS方法从血管内皮细胞损伤模型的细胞上清液中共鉴定出211个多肽,其中有19个具有显著差异表达,与正常对照组比较,表达上调6个,表达下调13个,通过UniProt数据库发现这些差异表达的多肽来源于16种前体蛋白。4.所鉴定出的多肽长度主要集中在9-14个氨基酸,分子量在1.2-1.4kDa之间,等电点富集在4-5之间。结论:1.1 μM浓度的Ang Ⅱ处理24小时是使用Ang Ⅱ的最适宜浓度和时间,以此构建稳定的血管内皮细胞损伤模型。2.从血管内皮细胞损伤模型的细胞上清液中筛选出差异表达多肽19个（表达上调6个,表达下调13个）,来源于16种前体蛋白,内皮细胞损伤后细胞上清中肽谱的变化提示多肽可能参与内皮细胞损伤后的应激过程。第二部分 多肽VMP-19在血管内皮细胞损伤中的作用研究目的:从差异高表达的血管内皮损伤多肽中筛选目标多肽,探讨其在血管内皮细胞损伤中的保护作用。方法:如前所述,使用1μM浓度的Ang Ⅱ处理人脐静脉内皮细胞24小时以建立内皮细胞损伤模型。选择第一部分研究中筛选出的多肽中p值最小的6条多肽,化学合成后加入所建的HUVEC损伤模型的细胞培养基中,采用CCK-8试剂盒进行细胞活力的检测,选取效果最为显著的多肽作为研究对象。化学合成这条多肽,及其作为对照肽的乱序肽（Scrambled peptide,Scr）加入内皮细胞损伤模型,应用CCK-8行细胞活力检测,并测定乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）与丙二醛（Malondialdehyde,MDA）,采用JC-1法检测线粒体膜电位,免疫印迹法（Western Blotting,WB）测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3,Cas 3）及聚腺苷酸二磷酸核糖多聚酶（Poly ADP-ribose polymerase,PARP）两种与细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果:1.序列为LLQDSVDFSLADAINTEFK的多肽加入内皮细胞损伤模型后其细胞活力（0.86±0.03）较Ang Ⅱ处理组（0.53±0.03）显著升高（p＜0.001）提示这条多肽可以显著增加AngⅡ处理的HUVEC细胞活力,根据其前体蛋白的名称和氨基酸数量,本研究将该肽命名为VMP-19（Vimentin derived peptide-19,波形蛋白衍生肽,19 个氨基酸）。2.在内皮细胞损伤模型中加入10μM、20μM和50μM三种浓度Scr的HUVEC细胞活力分别为（0.54±0.06）、（0.52±0.03）和（0.54±0.06）,与 Ang Ⅱ处理组（0.52±0.04）比较均无显著差异（p＞0.05）;而在模型中加入10μM、20μM和50μM三种浓度VMP-19的HUVEC细胞活力分别为（0.64±0.03）、（0.85±0.02）和（0.86±0.02）,与 Ang Ⅱ处理组（0.54±0.02）比较均有显著升高（p＜0.05或0.001）,提示VMP-19可以升高Ang Ⅱ处理的HUVEC细胞活力;在未经Ang Ⅱ处理的HUVEC对照组中分别加入0μM、10μM、20μM、50μM和100μM五种不同浓度的VMP-19多肽,其细胞活力分别为（1.00±0.03）、（1.02±0.02）、（1.00±0.03）、（0.99±0.02）和（1.01±0.06）,对照组组内比较无显著差异（p＞0.05）,说明浓度100μM以内的多肽VMP-19本身对人脐静脉内皮细胞的生长无影响。3.Ang Ⅱ+VMP-19处理组的细胞存活率（0.83±0.04）较Ang Ⅱ+Scr处理组（0.53±0.04）显著提高（p＜0.001）;Ang Ⅱ+VMP-19 处理组的 LDH（1.70±0.29）与 Ang Ⅱ+Scr 处理组（3.10±0.40）比较显著下降（p＜0.01）,提示VMP-19可以提高Ang Ⅱ处理的HUVEC细胞存活率,减轻细胞毒性作用。4.Ang Ⅱ+Scr 处理组的 ROS、SOD 和 MDA 水平分别为（21.46±4.54）、（37.67±7.49）U/mgprot和（9.43±1.37）nmol/mgprot,Ang Ⅱ+VMP-19 处理组的 ROS、SOD 和 MDA 水平分别为（6.44±1.14）、（65.93±3.91）U/mgprot和（4.49±0.33）nmol/mgprot。与Ang Ⅱ+Scr处理组比较,Ang Ⅱ+VMP-19处理组的ROS水平下降了近70.0%,SOD水平上升了 75.0%,MDA水平下降52.4%（均p＜0.01）,提示VMP-19肽可以抑制Ang Ⅱ处理的HUVEC氧化应激反应,减轻氧化应激损伤。5.Ang Ⅱ+Scr处理组的JC-1荧光密度（绿色/红色荧光比）、PARP相对密度和Cas 3相对密度分别为（1.89±0.16）、（2.73±0.45）和（0.99±0.17）,Ang Ⅱ+VMP-19 处理组的 JC-1荧光密度、PARP 相对密度和 Cas3 相对密度分别为（0.79±0.12）、（1.08±0.24）和（0.33±0.07）。与 Ang Ⅱ+Scr处理组比较,Ang Ⅱ+VMP-19处理组的JC-1荧光密度平均下降58.6%,PARP相对密度降低了60.3%,Cas 3相对密度则减少了 66.5%（p＜0.01或0.001）,提示Ang Ⅱ可引起人脐静脉内皮细胞凋亡,而VMP-19肽可以抑制Ang Ⅱ引起的HUVEC细胞凋亡。结论:1.VMP-19肽是本研究首次从血管内皮细胞损伤模型上清液中发现的一个新多肽,既往未见相关报道。2.VMP-19肽可以抑制Ang Ⅱ处理的HUVEC的细胞凋亡、降低细胞毒性,提升细胞活力,减轻氧化应激损伤,在体外具有保护血管内皮细胞的作用。