登革病毒(dengue virus,DV)是黄病毒属的单股正链RNA病毒,分为四个血清型(DV1-4)。DV是登革热(classical dengue fever,DF)和登革出血热/登革休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)的病原体。每年全世界热带与亚热带地区有1亿人感染DV,DV感染已成为一个严重的公共卫生问题。DHF/DSS表现为高热、出血、休克、病死率较高,但其发生机制不明,亦无有效的疫苗及治疗措施。血浆渗漏(plasma leakage)是DHF/DSS发生的一个重要特征,也是DV感染后病情恶化的重要指标之一。血浆渗漏往往来势凶猛,表现为血液浓缩,胸腔积液或腹水,但如果补液及时,病人可以在发病后1-2天恢复,不留后遗症。因此很多学者认为DV感染引起的血浆渗漏可能是由于血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)功能改变或者轻度的内皮细胞结构改变引起的。整合素是广泛分布在细胞表面的跨膜糖蛋白受体,由α和β亚单位构成,迄今已发现16种以上的α亚单位,9种以上的β亚单位,它们以不同的组合方式构成结构相似但具有配体结合特异性的20余种整合素分子。整合素作为信号受体,不仅介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用,并在细胞的生长、移行、增殖和分化等生理过程中发挥着重要作用。VEC表面整合素β1和β3含量丰富,最近研究发现整合素β3对维持毛细血管完整性,调节血管通透性方面起重要作用。整合素β3亚单位基因敲除后,引起的皮肤粘膜出血和血管通透性增加与汉坦病毒引起的肾出血热综合征的症状相似,且有学者证实汉坦病毒感染可以抑制整合素β3介导的VEC移行,从而提高血管的通透性。值得一提的是,汉坦病毒引起的肾出血热综合症的症状与DHF/DSS又极为相似,因此设想DV感染可能通过影响VEC上的整合素,破坏VEC维持的血管完整性,造成血管通透性增加,血浆渗出,引发DHF/DSS。本实验用DV2感染真皮微血管来源的HMEC-1和来源于人脐静脉内皮细胞的ECV304细胞株,检测DV2在两种内皮细胞中的增殖规律,病毒感染后细胞表面整合素的表达及功能的变化,以及细胞表面的整合素在DV2感染中的作用,探讨DV2感染与VEC相互作用的分子机制。主要的实验结果如下:(1) DV2感染可以上调整合素β3在HMEC-1和ECV304细胞中的表达首先,采用流式细胞技术,检测DV2感染的HMEC-1及ECV304细胞表面的整合素β1和β3的表达,样品的平均荧光强度代表了整合素的表达量。在整合素β3的检测中,HMEC-1感染后24hr,感染组平均荧光强度略高于对照组,随着感染时间的延长,样品的平均荧光强度逐渐增加,在感染后72hr达到峰值,是对照组的2.54倍(P<0.01,n=3)。说明DV2感染增强了整合素β3在HMEC-1中的表达。整合素β1的表达量于感染前后没有明显变化。ECV304细胞感染后,整合素β1和β3呈现了与HMEC-1相似的变化趋势。用感染复数(MOI)为1的病毒量感染HMEC-1时,上清中的病毒量于感染后72hr达峰值,为1.6×105PFU/ml。这与感染后整合素β3高表达的时相点一致,提示DV2对细胞的感染可能诱导了整合素β3的表达。同时,我们用实时定量(real time) RT-PCR的方法检测整合素β3的mRNA水平。利用2-ΔΔCt的分析方法分析,整合素β3的mRNA水平在DV2感染HMEC-1后逐渐升高,在感染后72hr达到峰值,是对照组的14.48倍(p<0.01,n=3),与流式细胞仪分析的结果趋势一致。进一步证明DV2感染能够上调整合素β3的表达。我们的结果与Raymond等在汉坦病毒的研究结果一致,Raymond等研究发现致病性汉坦病毒可以选择性抑制整合素β3直接介导的内皮细胞移行,流式细胞分析显示整合素β3的表达量明显升高。其原因目前尚不清楚,但我们知道整合素β3是细胞表面的一种糖蛋白受体,通过与细胞外基质的亲和力的变化,控制细胞的粘附和移行。整合素β3正常的生理功能的发挥有赖于这种受体与配体结合/解离的平衡。所以两种出血热病毒均可引起整合素β3的表达量升高,而临床上却表现为出血、血浆渗出,这一看似矛盾的现象可能是由于整合素β3过量表达,引起了细胞粘附与移行这一平衡的紊乱,造成血管通透性变化所致。DV2感染上调整合素的表达对整合素β3功能的影响有待进一步研究。对于DV2感染后整合素表达上调的分子机制,我们也做了初步的研究。蛋白质的mRNA水平高,一般由两方面因素决定,一是启动子活性增强,转录水平增高;二是mRNA降解减缓,导致的mRNA半衰期的延长。对于前者比较容易确定,本实验即用整合素启动子系列报告基因载体pGL3-1k和pGL3-1.3K,检测DV2感染后整合素表达上调是否由于整合素启动子活性增强,转录水平增高造成的。3次独立实验的结果显示,无论是ECV304细胞还是Vero细胞,DV2感染后各时相点,整合素启动子的活性均没有明显的变化。那么整合素表达量的变化,可能是病毒感染导致的mRNA降解减缓,mRNA半衰期的延长造成的,其中具体的作用机制还需要进一步证明。(2)免疫荧光染色显示HMEC-1中整合素β3与DV2的E蛋白共存用整合素β3的单克隆抗体与DV2 E蛋白的抗体对DV2感染后的HMEC-1进行免疫荧光双染色。未感染的HMEC-1用整合素β3的单克隆抗体染色,呈现较弱的荧光。感染后24hr荧光的强度无明显变化,随着感染时间的延长,整合素β3抗原的荧光强度逐渐增强,在感染后48hr和72hr,细胞均呈现较强的荧光。整合素β3抗原主要分布在核周和细胞膜上,与细胞内的DV2 E蛋白抗原有明显的共存。利用ECV304细胞,实施相同的感染实验,所得结果与HMEC-1一致。整合素β1抗原在感染前后的荧光强度没有明显变化,提示整合素β3可能与DV2的感染过程密切相关。(3)阻断整合素ανβ3的功能可部分的抑制DV2进入HMEC-1和ECV304细胞本实验先用整合素β1,αν,ανβ3的功能阻断抗体或配体纤维结合蛋白(fibronectin,FN)和玻粘蛋白(vitronectin,VTN)与培养细胞共孵育,观察对DV2进入细胞的抑制作用。在25μg/ml的浓度下,整合素αν和ανβ3的功能阻断抗体分别可以抑制30% and 38%的DV2进入HMEC-1。100μg/ml的FN和VTN的阻断效率分别为32%和23%(n=3)。整合素β1的功能阻断抗体,牛血清白蛋白(BSA)以及正常小鼠的IgG1在相应的浓度下均未出现阻断效果。利用ECV304细胞,实施相同的感染进入阻断实验,所得结果与HMEC-1一致。提示整合素β3在DV2进入细胞的过程中可能发挥比较重要的作用。(4)可溶性整合素ανβ3可以有效的阻断DV2进入HMEC-1和ECV304细胞为进一步证明整合素ανβ3在介导DV2进入内皮细胞中的特异性作用,在实施DV2感染实验之前,先用可溶性的整合素ανβ3或ανβ5与病毒孵育。可溶性的整合素ανβ3可以有效的阻断DV2的感染,其阻断作用具有剂量依赖特性。在2.5μg/ml的浓度下,仅出现部分阻断作用,当浓度达到10μg/ml时,阻断率几乎可达100%。而可溶性整合素ανβ5在10μg/ml的浓度时仅仅可以阻断约23%的病毒感染(n=3)。BSA则几乎没有阻断作用。结果提示整合素ανβ3可能特异性的与DV2相互作用,从而阻断病毒感染细胞。(5) RNA干扰方法下调整合素β3的表达,可降低DV2的感染率为进一步证实整合素ανβ3是否为DV2进入宿主细胞所必需的,我们用RNA干扰的方法下调整合素β3的表达。构建特异性针对人整合素β3的干扰质粒p1262和p1932,转染ECV304细胞后48hr用流式细胞计数法检测瞬时转染的干扰效果:转染干扰质粒的细胞平均荧光强度均比对照组(转染空质粒pSlienser)有明显下降,提示本次构建的干扰质粒确实可以降低整合素β3的表达水平。在此基础上,我们通过G418,筛选了低表达整合素β3的稳定转染细胞株。经过2轮筛选,共得到5个细胞克隆,其中转染p1262的有两株(G6,F8),转染p1932的有三株(9-1,F10,G10),流式细胞计数显示G6中整合素β3的表达水平下降最为明显,仅为对照组的38%。我们将G6克隆命名为ECV-β3(-)。利用上述细胞株进行DV2感染实验,与对照组相比,在ECV-β3 (-)中,DV2的感染率下降了89%,提示整合素β3可能是DV2进入ECV304细胞所必需的。(6)在CHO-K1细胞中重建整合素β3受体可以提高DV2的感染率CHO-K1是来源于中国仓鼠卵巢上皮的细胞系,常用于异源整合素的表达。用DV2感染CHO-K1细胞后不同时相点取培养上清,进行病毒滴度测定,发现病毒在CHO-K1中的增殖滴度较低,最高滴度为1.65×104PFU/ml。而ECV304细胞或Vero细胞,在相同的感染条件下,DV2的最高滴度可达1.34×106PFU/ml和1×107PFU/ml。本实验将表达人整合素β3的质粒转染CHO-K1细胞,用G418筛选单克隆细胞,通过流式细胞检测,建立了稳定表达整合素β3的CHO-K1细胞。利用该细胞株进行感染实验,观察了人整合素β3稳定表达的CHO-K1对DV2易感性的变化。与转染空质粒的对照组CHO-K1细胞相比,发现DV2进入稳定表达整合素β3的CHO-K1细胞株的病毒量有所增高,增高的比例与整合素β3的表达增高趋势基本一致,进一步说明了整合素ανβ3在DV2感染过程有重要作用。CHO-F8细胞是所筛选到的整合素β3表达最高的细胞克隆,感染后0hr进入细胞中的病毒为5×102PFU,而相同的感染条件下进入ECV304细胞或Vero细胞的病毒可达5×104PFU。因此认为,整合素β3是DV2进入内皮细胞所必需的蛋白,但不是惟一的蛋白,若要确定还有哪些蛋白参与了DV2进入内皮细胞的过程,尚需要进一步研究。综合上述结果,DV2感染可以诱导整合素β3高水平的表达,整合素β3的表达上调可能有助于病毒进入宿主细胞。本实验的结果为揭示整合素β3在DV感染的病理过程中的作用提供了重要的理论基础。对于整合素β3与病毒蛋白的结合位点以及DV2感染上调整合素β3的分子机制还有待进一步研究。