目的:局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）是导致终末期肾脏病（ESRD）的主要病因之一。研究FSGS的发病机制,寻找新的治疗方法或特异性靶向药物非常重要。近年有报道circZNF609可以作为多种微小RNA（miRNAs）的“海绵”,参与一些人类疾病的发生与发展,但其在肾脏病FSGS中的生物学作用尚未报道。本研究旨在探讨环状RNA中的circZNF609在FSGS中是否发挥“海绵”作用及其分子机制,为明确circZNF609能否作为治疗FSGS的潜在新靶点提供理论依据。研究方法:1、选取肾活检明确诊断的原发性FSGS患者90例,其中病理类型非特殊型（NOS）、顶端型（Tip）和细胞型（Cellular）各30例。收集患者如下临床信息:肾活检病理中硬化肾小球数占总的肾小球数的百分比、估算肾小球滤过率（e GFR）、24小时尿蛋白定量（UTP）、血清白蛋白（ALB）、血清总胆固醇（TC）、血清肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）。收集与FSGS组性别、年龄匹配的对照者30例,正常对照肾组织取自泌尿系统肿瘤患者全肾切除术后,选癌旁5厘米以上肾组织,由肾脏病理医生确认为形态正常肾组织,作为正常对照组。肾脏组织采用糖原（PAS）染色、马松（Masson）染色,观察病理变化,免疫荧光（IF）检测足细胞损伤特异性蛋白-Wilms肿瘤蛋白1（WT1）和促纤维化蛋白-Ⅰ型胶原蛋白α1（COL1A1）表达变化。荧光标记的原位杂交技术（FISH）确定circZNF609在肾组织内的定位与表达变化,并对肾组织中circZNF609的表达强度与传统临床生化指标进行相关性分析。2、选取雄性11周龄BALB/c小鼠48只,随机分为两组:安慰剂正常对照（NC组）24只小鼠,ADR诱导FSGS组24只小鼠。FSGS造模通过阴茎静脉注射10.5mg/kg盐酸阿霉素（ADR）,正常对照组注射等剂量生理盐水。ADR静脉注射后5天、2周、4周、6周,分别收集小鼠尿液检测小鼠尿白蛋白、尿肌酐,计算尿白蛋白/尿肌酐（UACR）比值,收集小鼠外周静脉血,检测小鼠Scr、BUN、ALB、TG、TC、血清低密度脂蛋白（LDL）,上述四个时间点分别收集血、尿后予以二氧化碳麻醉NC组及ADR诱导FSGS组小鼠各6只,4℃生理盐水肾脏灌流,除掉血细胞至肾脏由红色变为白色后收取肾组织,留作组织学与分子生物学检测。1/4肾组织予以4%多聚甲醛固定48小时,用于病理包埋切片制做石蜡切片行PAS及Masson染色,明确FSGS病理形态学变化。行PAS、Masson染色确认是否发生FSGS,免疫组化（IHC）检测足细胞蛋白（Podocin）、转化生长因子-β1（TGF-β1）,FISH检测肾组织石蜡切片中circZNF609和miR-615-5p（已知与circZNF609有结合位点的miRNA）表达变化。1/4肾脏提取蛋白质,利用蛋白免疫印迹（Western blotting）技术检测足细胞特异性蛋白WT1、Podocin和促纤维化蛋白COL1A1、TGF-β1的蛋白表达水平。1/4肾组织提取RNA,利用实时定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）技术分析肾脏内circZNF609和miR-615-5p的RNA表达水平。1/4肾组织用于制作冰冻切片,用于免疫荧光染色,检测WT1、COL1A1表达定位与蛋白水平变化。分析肾组织中circZNF609、miR-615-5p与UACR、生化指标（Scr、BUN、ALB、TG、TC、LDL）、足细胞损伤指标及纤维化指标的相关性。3、FSGS为足细胞损伤为主的肾小球疾病,大量蛋白尿对肾小管细胞具有毒性,造成肾小管上皮细胞损伤,导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化,最终进展为ESRD。因此我们选取人足细胞与肾小管上皮细胞HK2行细胞培养及研究。由于足细胞培养及转染circZNF609失败,所以我们侧重研究circZNF609在FSGS发展过程中参与白蛋白对肾小管上皮细胞的损伤机制。我们选取经典的肾小管上皮细胞株HK2细胞。于HK2细胞爬片后FISH及IF检测circZNF609、miR-615、COL1A1是否共表达。具体方法如下:HK2细胞培养密度为1.0×105个/ml,待细胞贴壁后,将HK2细胞在没有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养12小时,之后将HK2细胞随机分成以下两组:1)对照组,在DMEM/F12培养基中培养的HK2细胞;2)牛血清蛋白（BSA）组,BSA模拟足细胞损伤后滤过的大量尿蛋白,在含有4 mg/ml BSA的DMEM/F12培养基中培养的HK2细胞。24小时后收获细胞提取细胞总RNA和蛋白质检测circZNF609和miR-615-5p以及纤维化指标COL1A1、TGF-β1的表达变化,分析circZNF609与miR-615-5p水平之间的相关性,以及circZNF609、miR-615-5p分别与纤维化指标COL1A1、TGF-β1相关性。HK2细胞培养密度均为1.0×105个/ml,待细胞贴壁60-70%时转染circZNF609质粒及阴性对照质粒,提取细胞总RNA和蛋白质检测circZNF609和miR-615-5p以及纤维化指标包括COL1A1、TGF-β1的表达变化。结果:1、FSGS患者临床表现为肾病综合征包括大量蛋白尿、低蛋白血症与高脂血症,常伴e GFR下降。肾活检PAS、Masson染色提示病理改变符合FSGS表现。与正常对照组相比,IF检测FSGS患者肾组织足细胞损伤特异性蛋白WT1表达减少和纤维化相关蛋白COL1A1表达增加。FISH检测示circZNF609表达于肾小球和肾小管,且FSGS患者肾组织中circZNF609表达增加。circZNF609与TC及Scr呈正相关,与ALB及e GFR呈负相关。2、ADR注射5天时,BALB/c小鼠出现蛋白尿,且蛋白尿随着观察时间的延长而增加。6周时BALB/c小鼠出现低蛋白血症、高脂血症、BUN升高,Scr无明显变化。PAS、Masson染色病理改变符合FSGS,表明小鼠FSGS造模成功。Western blotting检测显示ADR诱导的FSGS组小鼠肾组织足细胞特异性蛋白WT1和Podocin表达均下调,纤维化相关蛋白COL1A1和TGF-β1表达均上调。免疫染色显示WT1和Podocin表达下调,COL1A1和TGF-β1表达上调,与Western blotting变化趋势一致。RT-q PCR检测FSGS小鼠肾脏circZNF609表达增加,miR-615-5p表达减少。FISH检测circZNF609和miR-615-5p共表达在肾小球和肾小管上,且ADR诱导的FSGS小鼠肾组织circZNF609表达增加,miR-615-5p表达减少,二者呈负相关。circZNF609与UACR、TC、TG、BUN呈正相关,与ALB呈负相关,与Scr无明显相关性。circZNF609与足细胞损伤特异蛋白WT1、Podocin呈负相关,与纤维化相关蛋白TGF-β1呈正相关,与COL1A1无明显相关性。miR-615-5p与足细胞损伤特异蛋白WT1呈正相关,与纤维化相关蛋白COL1A1呈负相关,与Podocin、TGF-β1无明显相关性。3、HK2细胞爬片,circZNF609、miR-615-5p和COL1A1通过FISH和IF共定位检测发现三者共表达于细胞质。4mg/ml的BSA处理HK2细胞24小时后,纤维化相关蛋白COL1A1和TGF-β1表达增加,更重要的是circZNF609表达上调,miR-615-5p表达下调,二者呈负相关。HK2细胞过表达circZNF609后,miR-615-5p表达下调,纤维化相关蛋白COL1A1和TGF-β1表达增加。无论BSA处理HK2细胞还是HK2细胞过表达circZNF609,相关性分析提示circZNF609与miR-615-5p呈负相关,circZNF609与COL1A1和TGF-β1呈正相关,miR-615-5p与COL1A1和TGF-β1呈负相关。结论:1、circZNF609在FSGS患者的肾脏组织中表达上调,肾组织中circZNF609与TC及Scr呈正相关,与血清ALB及e GFR呈负相关,提示circZNF609参与FSGS的发生与发展。2、ADR可诱导雄性BALB/c小鼠发生FSGS,小鼠肾组织circZNF609表达增多,与FSGS患者肾组织circZNF609表达增多趋势相一致,模拟了临床FSGS的表达变化,且circZNF609与miR-615-5p表达呈负相关,提示circZNF609与miR-615-5p共同参与FSGS发病与疾病进展。ADR组小鼠肾组织纤维化相关蛋白COL1A1和TGF-β1表达增加,提示circZNF609通过下调miR-615-5p参与了FSGS的肾纤维化进展。3、虽然我们没有在足细胞中成功完成circZNF609转染实验,但在BSA处理后的HK2细胞中,circZNF609、miR-615-5p、COL1A1表达的变化与动物实验一致,提示circZNF609、miR-615-5p、COL1A1参与FSGS中足细胞损伤后大量蛋白尿造成的肾小管损伤,促进纤维化;进而HK2细胞过表达circZNF609后,miR-615-5p表达下调,COL1A1表达上调,为circZNF609海绵下游靶基因miR-615-5p,进而调控miR-615-5p下游靶蛋白COL1A1,参与FSGS的肾纤维化增加了进一步证据。