【研究背景】癫痫是大脑神经元突发性异常放电,导致短暂的大脑功能障碍的一种神经系统常见的慢性疾病,广泛影响着全世界约7000万患者的生命健康。癫痫的病因复杂,包括遗传因素、脑部疾病和全身或系统性疾病等,其临床表型多样,具有高度的异质性。目前,有多种癫痫治疗手段应用于临床,包括抗癫痫药物治疗（Antiseizure medication,ASM）、手术治疗、神经调控治疗和饮食治疗,但药物治疗仍是临床是上治疗癫痫的主要手段。尽管,近些年来,随着新药的研发,越来越多的新型ASM投入临床使用,这为癫痫患者的治疗带了福音。然而,仍有约三分之一的癫痫患者在治疗过程中对现有的治疗药物产生耐药,导致癫痫患者的治疗效果不佳,进而发展成为药物难治性癫痫。此外,有研究表明,已发展为药物难治性癫痫患者,采用其他新型ASM治疗相对未发展为药物难治性癫痫患者治疗效果较差。因此,探索药物难治性癫痫的发生及对ASM耐药的机制对改善癫痫的诊断及治疗具有重要的意义。生物信息分析学是一门在生命科学的研究中,以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。近些年来,随着测序价格的下降、分析技术的发展和越来越多权威公开数据库的建立,生物信息分析技术被广泛应用于肿瘤预后分子标志物预测,免疫治疗效果预测,药物筛选等多个领域内。在临床应用方面,区别于传统的统计学分析手段,生物信息分析技术还结合了多种复杂分析手段和机器学习算法,加上反复的重复分析,使得分析结果更为精准可靠。在机制研究方面,不同于传统研究根据文献报道和少量临床样品来发掘研究方向,通过在生物信息分析中使用大量的测序结果更能保证研究的准确与可信,避免了由于个别现象导致的假阳性结果,可以更加明确研究方向的正确性,从而可节省研究者大量的时间和科研经费。目前,针对药物难治性癫痫的研究,多集中于临床病例报道,队列研究,以及部分的基础机制研究,尚未有学者应用生物信息分析技术于该领域内的研究。目前,对于患者对ASM耐药预测的研究,多集中采用META分析,未曾有构建精准的预测模型的先例。且临床上药物基因检测涉及基因数量较少,价格昂贵,具有一定的局限性。因此,探索构建一个准确的ASM耐药模型有一定的必要性。对于目前药物难治性癫痫的机制发掘,多从基因检测的结果入手,多数研究集中于单个基因或数个基因的研究,较为局限,并未分析机体整体的基因表达的改变和相关通路的改变。对于目前,药物难治性癫痫潜在的全面的分析较少,且有待进一步开展相应的分析来对更深层次的机制进行进一步的发掘。【研究目的】（1）在耐药性癫痫数据中,筛选与ASM耐药密切相关的耐药基因（2）根据筛选出的耐药相关基因,建立癫痫耐药预测模型,以帮助临床上筛选药物难治性癫痫患者。（3）分析耐药基因的表达,以及之间的相互作用关系,探索耐药基因在癫痫耐药中发挥的潜在作用。（4）通过相关的通路分析,探索在癫痫耐药中发挥作用潜在的通路。【研究方法】（1）搜集来自基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库基因表达综合集143272样本的外周血转录组数据和临床数据,样本类型包括健康对照样本,未进行药物治疗的癫痫患者样本,药物治疗敏感及耐药样本。（2）构建加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA）网络,分析各个模块的相关性,并选与不同药物耐药相关的模块作为关键模块。（3）通过套索（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator,LASSO）回归及支持向量机（Support Vector Machine,SVM）算法分别筛选关键耐药基因,建立相应的耐药预测模型,并通过ROC曲线验证模型的准确性和一致性。（4）分析耐药基因的不同表型分组的表达量情况,以及其之间的相关性。（5）蛋白互作网络（Protein Protein Interaction Network,PPI）分析对耐药基因的蛋白互作关系分析。（6）创新通路分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）对耐药基因进行通路分析和和化学/药物等物质的相互作用网络分析。【研究结果】（1）本研究最后共纳入141例样本,包括来自正常健康人的50例,未接受药物处理的癫痫样本34例和经药物处理的癫痫样本57例。（2）通过进行WGCNA分析,我们发现本样本整体聚类良好,根据基因的相关性,构建了相应的共表达网络。根据与临床的相关性,我们采用关注临床性状和药物耐药情况构建了卡马西平耐药基因模块,苯妥英耐药基因模块和丙戊酸耐药基因模块。（3）通过在相应的耐药基因模块中应用LASSO回归和SVM算法,并对结果取交集,我们筛选出了11个卡马西平耐药标志分子,4个苯妥英药物标志分子和5个丙戊酸耐药标志分子。取并集后得到了17个关键耐药分子。最终根据这17个基因,我们构建了一个三分类的SVM的预测模型。我们对模型绘制ROC曲线检测其预测准确性,最终得到曲线下的面积AUC几乎为1,证明了我们模型良好的预测能力。（4）此外,17个关键耐药基因在正常人和癫痫患者之间存在有显著的表达,在患者中出现显著的表达上调。其中有12个耐药基因在三种耐药基因组之间有着显著的表达差异。通过相关性分析,我们发现17个耐药基因均呈现显著的正相关。（5）PPI分析结果表明,共有10个关键耐药基因形成了完整的蛋白互作闭环网络,其中RUNX3、SKAP1、GPR56和KLRD1基因位于该网络的中心部分,证明这些基因可能在癫痫耐药中发挥核心作用。（6）最后,通路分析结果表明27个耐药基因参与疾病和功能关联的通路。其中排名最高的信号通路是辅助性T淋巴细胞1和辅助性T淋巴细胞2激活通路,表明耐药基因可能通过参与患者免疫反应的调节来导致癫痫耐药。此外,耐药关键基因PRKCH和S1PR5可能通过调节CREB信号通路来与其他耐药相关基因发挥协调作用。【结论】（1）在药物难治性癫痫临床研究方面:我们首次使用生物信息分析技术WGCNA在癫痫样本数据集中构建与临床特征相关的耐药模块,并识别ASM耐药相关基因。通过应用LASSO回归和SVM-FRE算法进行特征选择,我们首次筛选出了17个与耐药性癫痫高度相关的关键耐药基因。最后,我们首次构建了一个三分类的癫痫耐药预测模型,其可以准确预测癫痫患者的耐药,并有望投入临床应用。（2）在药物难治性癫痫机制探索方面:我们通过对癫痫耐药相关基因进行PPI分析,构建了一个蛋白互作的网络,其中CCDC102A、FGFBP2、RUNX3、SKAP1、KLRD1和PRSS23基因位于网络核心部位,其形成了一个复杂的耐药闭环网络,该网络中的相互调节可能是患者产生耐药的重要原因。IPA通路分析结果表明,耐药关键基因PRKCH和S1PR5可能通过调节CREB信号通路来与其他耐药相关基因发挥协调作用。我们的研究为进一步开展药物难治性癫痫机制研究方向提供了相应的提示。