核酸是重要的生物大分子,通过复制、转录和翻译对遗传信息进行储存和传递。核酸具有多态性,通过碱基之间的Watson-Crick氢键和Hoogsteen氢键连接形成多种二级结构,包括发卡环、三联体、G-四链体（G4）和i-motif等。其中G-四链体由富含鸟嘌呤的核酸折叠而成,四个鸟嘌呤形成二维G-平面结构,两个以上的G-平面通过π-π堆叠作用构建稳定的G4。G4广泛存在于基因组中,并且参与DNA复制、转录和翻译等多种生物过程,具有关键的调控作用,已成为目前最为引人关注的核酸二级结构。G4的精准可视化检测对阐明生物复杂体系中G4的结构与功能具有重要意义。有机荧光探针具有易合成、易修饰以及重现性好等优点。近年来,特异性识别G4的有机荧光探针得到飞速发展。此类探针一般以结构骨架为基础进行适当的修饰以满足不同的需求,为G4的实时检测、原位成像以及生理过程的示踪提供了不可或缺的工具。探针中微小的结构改变会导致截然不同的G4结合性质以及细胞成像表现,因此开发构建G4荧光探针的新型模块对合理设计G4探针尤为重要。现有的模块修饰方案大多合成限制较多,普适性较差。另一方面,已报道的近红外发射的G4荧光探针数量较少,由于亚细胞器积累的干扰、中等的选择性、或者较差的光物理性质,难以实现活体内的G4成像,限制了其在生物体内的进一步应用。荧光蛋白生色团因其优异的荧光特性引起了人们的广泛关注,并被应用于荧光适配体和G4结构等核酸相关领域。基于此,本论文的研究工作基于分析化学、有机化学以及生物科学等领域的交叉,从有机荧光分子发光原理以及化学结构修饰入手,以荧光蛋白生色团为核心,设计合成一系列具有优异光物理性质的G4荧光探针,为G4荧光染料现有的瓶颈问题提供新的解决方案。具体研究内容如下。（1）模块化修饰构建特异性识别正平行G-四链体结构的探针。受到Ds Red荧光蛋白生色团的启发,我们提出新型模块化分子修饰策略,将肟基引入绿色荧光蛋白生色团咪唑啉酮的2位,设计了一种新型荧光团1c。该修饰为分子的性质带来巨大的影响,极大增强了分子与G4的结合能力,并且伴随着明显的波谱红移。更重要的是,模块化修饰后的探针对正平行G4具有明显的拓扑结构选择性。此外,该修饰策略反应条件温和、合成步骤简单,能够应用于多种荧光蛋白生色团和其他G4探针骨架（三芳基咪唑骨架和三苯胺骨架）的改造。以上修饰后的荧光探针均能特异性识别正平行G4,表明该模块化修饰策略具有一定的通用性。（2）模块化修饰分子用于逻辑门的构建以及细胞内G-四链体成像。核磁共振实验表明模块化修饰的探针与G4的结合模式为末端堆叠,分子对接结果显示分子中的肟基与G4存在关键的氢键作用。基于肟基修饰的探针特异性识别正平行G4的优异特性,结合阳离子对G4序列PW17构象调控的特点,以G4构象切换为基础,探针3b的荧光信号为输出,我们构建了两种新型逻辑门,为核酸逻辑门的设计提供新的思路,也为免标记DNA逻辑纳米平台的构建提供了新型有力工具。最后,探针3b与细胞成像结果证明该探针能够特异性识别核仁中的DNA G4,进而实现细胞内G4的成像,为揭示细胞内G4的生物功能提供了有效工具。（3）近红外发射G-四链体荧光蛋白模拟物（igMFPs）的构建。基于课题组前期以G4为载体构建的红色荧光蛋白模拟物的工作,我们引入供体-受体-受体（D-A-A’）的设计理念。分别对分子的电子受体以及供体部分分步进行调整,有效增大分子内的电荷转移效应,达到波长红移的目的,得到了一系列近红外发射的荧光蛋白生色团。利用G4结构激活荧光蛋白生色团NIR-1、NIR-2和NIR-3的荧光,成功构建近红外发射的荧光蛋白模拟物（分别命名为igMFP-1、igMFP-2和igMFP-3）。其中igMFP-2和igMFP-3的最大发射波长分别达到689 nm和705 nm,在活体成像中具有较强的组织穿透能力,展现出活体内成像的巨大潜质。此外,igMFPs具有高量子产率、抗光漂白能力强以及大斯托克斯位移的优异光物理性质。粘度敏感性实验表明NIR-2具有更高的粘度敏感性以及更低的旋转能垒,在高粘度的细胞环境中与G4结合表现出更高的信背比,更适用于细胞内G4的高对比度成像。（4）igMFPs用于细胞以及活体内的HCV G-四链体成像。相关文献报道丙型肝炎病毒基因组中核心序列存在高度保守的G4结构,因此我们选取该G4结构（命名为CG2a）作为模板,对igMFPs在细胞以及活体中的成像表现进行探究。NIR-2能够原位产生基于CG2a的igMFPs,进而实现CG2a体外转录动力学的实时监测以及细胞内CG2a转染体系的成像。随后,我们继续将NIR-2应用于HCV基因组感染细胞系GG2中病毒的成像。NIR-2能够快速进入细胞,特异性结合HCV基因组中的G4结构原位产生igMFPs,提供精确的HCV RNA基因组空间信息,实时分析病毒RNA的亚细胞分布,成功实现了HCV基因组的可视化检测。最后将igMFPs作为荧光标签应用于小鼠体内HCV基因组的实时成像。这是首次将荧光蛋白模拟物用于活体成像,实现了活体内病理相关的内源G4的实时可视化检测。