乳腺癌是一种异质性疾病,根据基因表达可以分为四型:管腔上皮A型、管腔上皮B型、Her2过表达型及基底样型。与其他亚型比较,基底样乳腺癌与临床侵袭、早期复发、远处转移和生存率低密切相关。基底样乳腺癌好发于年轻和绝经前期妇女并且在早期容易发生肺和脑转移。临床上由于基底样乳腺癌缺乏有效的靶向治疗药物,病人预后差。对基底样乳腺癌转移的分子机制的研究是靶向治疗的一个重要条件。基底样乳腺癌具有明显的EMT过程,EMT在肿瘤侵袭及转移过程中起重要作用。EMT是一种表型转换,参与胚胎发育、组织重塑、伤口愈合及肿瘤转移等过程。在EMT过程中,上皮细胞失去上皮特征,成为具有移动潜能的间质细胞。更重要的是EMT可以使肿瘤细胞具有干细胞特征。在EMT过程中,肿瘤细胞在迁移过程中通常经历着外界组织的艰难环境,它们必须代谢重组和改变发生途径,从而生存,进而转移。明确EMT和代谢变化之间的关系有助于发现乳腺癌的靶向治疗方法。代谢重组通常被认为是肿瘤的重要特征。在脂肪代谢过程中,有许多重要的活性分子。花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸,通过一系列的催化反应,可以代谢生成前列腺素、羟过氧化二十碳四烯酸、环氧-二十碳三烯酸。花生四烯酸相关的酶及代谢产物参与多种疾病的病理生理过程如:肿瘤。AKR1B1可以催化PGH2生成PGF2α。在花生四烯酸代谢过程中,AKR1B1是一种NADPH依赖的PGF2α合成酶。PGF2α是AKR1B1催化的主要代谢产物。PGF2α通过PGF2α受体调节肿瘤内皮细胞的信号通路,从而调控细胞的粘连、侵袭迁移,AKR1B1可能通过调控脂肪代谢从而参与肿瘤的发生发展。依帕司他是AKR1B1抑制剂,已经被广泛的应用于糖尿病的治疗。依帕司他很容易被组织吸收,而且副作用较小。我们推测依帕司他可以抑制AKR1B1的活性,进而抑制基底样乳腺癌的发生发展。因此我们致力研究和探讨AKR1B1对基底样乳腺癌的发生发展的作用及分子机制,并且进一步明白AKR1B1抑制剂依帕司他对基底样乳腺癌发生发展的作用。首先,我们通过生物信息学分析发现AKR1B1在基底样乳腺癌中的表达比其他亚型明显升高。为了验证该结果,我们收集了乳腺癌组织和细胞样品,进行了Westernblotting、半定量RT-PCR定量与PCR实验,检测AKR1B1及EMT标记物表达。我们发现AKR1B1在基底样乳腺癌中明显高表达,而在管腔型乳腺癌中几乎不表达。在研究Twist2诱导EMT时,我们很偶然发现Twist2可以促进AKR1B1的表达。为了明确Twist2与AKR1B1的关系,我们利用生物信息学技术对Twist2与AKR1B1共表达关系进行分析,我们发现AKR1B1表达与Twist2表达成正相关。为了研究它们的相互关系,我们建立了 Twist2高表达及干扰稳定表达细胞株,我们发现Twist2的表达可以抑制E-cad和促进AKR1B1的表达并且诱导细胞形态发生变化。这些结果表明Twist2作为一个转录因子,可以促进AKR1B1的表达。为了验证Twist2是否直接调控AKR1B1的表达。我们分析了 AKR1B1的启动子,并对AKR1B1的启动子进行截短、突变并构建报告基因质粒。我们在293T、MDA231和SUM159细胞中进行报告基因实验和ChIP实验。我们实验结果证实AKR1B1是Twist2的靶基因,并且发现-997位点上的E-box是一个重要结合位点。为了研究AKR1B1的分子作用和机制,我们建立了 AKR1B1的高表达及干扰稳定细胞株。并进行Westernbloting实验、Transwell侵袭和转移实验、报告基因实验,我们证实了 AKR1B1在这些细胞中与EMT密切相关。我们发现AKR1B1可以抑制E-cad的表达及E-cad启动子的荧光素酶的活性,促进细胞的侵袭和转移。我们的结果证实AKR1B1在诱导EMT和促进肿瘤的侵袭和转移过程中起重要作用。PGF2α是AKR1B1催化的一个重要产物。为了研究AKR1B1在代谢途径中的作用,我们利用Elisa试剂盒分别检测PGF2α在AKR1B1高表达、干扰稳定细胞株中的合成情况。我们实验结果表明在基底样乳腺癌中AKR1B1可以促进PGF2α合成。AKR1B1是NADPH依赖性的细胞质的单体酶,可以使NADPH/NADP比值降低。NADPH/NADP比值降低可以导致氧化应激。为了验证AKR1B1对氧化应激的影响,我们对ROS进行检测。我们实验结果发现AKR1B1可以促进ROS产生。由于NF-1κB是对氧化还原敏感的转录因子,通常认为是ROS的传感器。AKR1B1调控ROS的产生可能参与NF-κB信号通路激活。我们进行了Westernblotting实验和报告基因实验,我们发现AKR1B1的高表可以明显增加Re1A的水平,并且明显增强NF-κB报告基因的活性。已经有报道证实NF-κB信号通路可以调控EMT。为了研究AKR1B1如何通过NF-κB信号通路调控EMT。在AKR1B1高表达及干扰稳定表达细胞株中,我们用Westernblotting检测RelA和EMT转录调控因子的表达情况。我们发现AKR1B1的表达可以增加RelA和Twist2的表达。TNF-α和IL-1β是NF-κB的激动剂。因此,我们利用TNF-α和IL-1β刺激MDA231和SUM159细胞,我们发现在MDA231和SUM159中,RelA的表达可以被TNF-α和IL-1β诱导。更为重要的是,在这些细胞中,Twist2的表达也可以被TNF-α和IL-1β诱导。这些结果提示我们Twist2的表达与RelA的表达成正相关。为了进一步研究RelA与Twist2之间的关系,我们建立了 RelA高表达及干扰稳定表达细胞株。我们发现RelA可以促进Twist2的表达,这些结果表明RelA对Twist2的表达起重要调控作用。为了验证RelA是否直接调控Twist2的表达。我们对Twist2的启动子进行分析,并对Twist2的启动子进行截短、突变并构建报告基因质粒,并进行报告基因实验和ChIP实验,我们结果表明RelA直接结合到Twist2的启动子上,从而调控Twist2表达。在很多实体瘤中通常含有少数致瘤性的肿瘤干细胞,它与肿瘤的复发和转移密切相关。EMT可以使细胞具有肿瘤干细胞的特性。在基底样乳腺癌中由于AKR1B1呈高表达,与EMT密切相关。AKR1B1可能与肿瘤干细胞相关。为了验证AKR1B1与基底样乳腺癌细胞干细胞之间关系,我们利用AKR1B1高表达及干扰稳定细胞株进行细胞球实验及利用流式细胞仪检测CD44high/CD24low,我们发现AKR1B1可以明显促进细胞球的形成及提高CD44high/CD24low的比例。肿瘤干细胞具有明显的致瘤性和转移性。然后,为了验证AKR1B1对肿瘤成瘤能力的影响,我们进行了软琼脂糖克隆形成实验及小鼠成瘤实验。我们发现无论是在体内或体外,AKR1B1可以明显促进细胞克隆和肿瘤的生长。为了验证AKR1B1对肺转移的影响,在活体动物模型中,我们发现干扰AKR1B1表达明显抑制活体动物的肺转移。我们的实验结果表明在基底样乳腺癌中AKR1B1的表达在肿瘤的致瘤性和转移过程中起重要作用。依帕司他是AKR1B1的抑制剂,可以抑制AKR1B1的活性,为了验证依帕司他是否对基底样乳腺癌起作用,我们利用依帕司他处理乳腺癌细胞,进行一系列实验,我们发现依帕司他可以恢复E-cad的表达及AKR1B1对E-cad启动子的抑制,可以抑制PGF2α的产生、细胞球的形成、CD44high/CD24low的百分比及肿瘤的生长和侵袭。我们实验结果表明依帕司他可以抑制乳腺癌的发生发展。为了验证AKR1B1与临床的关系,我们进行了生物信息学分析,我们发现AKR1B1高表达的病人生存期较短,高表达AKR1B1的原发肿瘤易发生脑转移和肺转移。这些临床结果,再次证实了 AKR1B1在基底样乳腺癌中起重要作用。综合上述研究结果,我们得出以下结论:1.AKR1B1在基底样乳腺癌高表达,与乳腺癌预后差密切相关。2.AKR1B1通过Twist2介导的正向反馈调控EMT。3.AKR1B1细胞具有干细胞的特性从而促进肿瘤的致瘤性和转移性。4.依帕司他,一种AKR1B1抑制剂,可以明显抑制基底样乳腺癌的发生和发展。