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【目的】利用分子克隆技术,构建酵母真核重组表达载体pPIC9K-U1RNP70K,采用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在毕赤酵母SMD1168中诱导U1RNP-70K的分泌表达获得目的蛋白,并应用初步纯化的真核产物建立DIGFA法检测抗U1RNP-70K抗体,辅助MCTD的诊断。【方法】1、以人白血病HL-60细胞的cDNA文库为模板,PCR扩增人U1RNP-70K全长基因序列,将PCR产物回收、纯化后直接进行TA克隆、测序鉴定,并将测序正确的TA克隆和含真核重组表达载体pPIC9K抽质粒双酶切后定向克隆,用电穿孔法将pPIC9K-U1RNP70K重组质粒DNA线性化后导入毕赤酵母SMD1168中,成功构建酵母真核重组表达载体,获得U1RNP-70K毕赤酵母。2、将获取的U1RNP-70K毕赤酵母菌接种于G418平板,筛选出高表达的重组菌,并对高表达重组菌进行PCR鉴定;诱导U1RNP-70K酵母菌的分泌表达获得目的蛋白,经硫酸胺浓缩沉淀,通过SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。3、将重组蛋白U1RNP-70K点于硝酸纤维素(NC)膜上,与待检血清中U1RNP抗体反应后,以胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(Staphylococus protein A,SPA)作为显示剂,与截留的抗U1RNP抗体结合,出现肉眼可见的红色斑点,建立斑点免疫金渗滤法(DIGFA);并与ENA自身抗体谱斑点酶免疫法检测试剂盒(欧蒙杭州医学实验诊断有限公司)进行结果比对和临床评价。【结果】1、以人白血病HL-60细胞的cDNA文库为模板,扩增出人U1RNP-70K PCR产物,对其进行TA克隆后提取重组质粒经双酶切后送测序,TA阳性克隆测序图谱与Genebank报道的完全一致。2、成功地构建出U1-70K抗原酵母真核表达载体,提取pPIC9K-U1RNP70K重组质粒经双酶切后送测序,测序结果表明插入片断阅读框和方向正确。3、通过电转化基因导入仪将目的片段导入毕赤酵母菌SMD1168,获取了U1RNP -70K酵母菌,重组菌经甲醇诱导后表达的产物进行SDS-PAGE电泳分析,得到相对分子量约66kD的U1RNP-70K表达产物。4、和斑点酶免疫法相比,检测结果表明两种方法的阳性符合率为94.73%,阴性符合率为98%,总体符合率为96%,结果能与斑点酶免疫法相符合。【结论】本研究在国内外首次成功构建了酵母真核重组表达载体pPIC9K-U1RNP70K,并建立检测抗U1-RNP抗体的DIGFA法,该方法操作简单,快速,检测结果能与斑点酶免疫法相符合,待进一步研究后,在临床上会有较大的应用价值。