背景由男性重要的性腺器官前列腺引起的疾病在不同的年龄阶段有不同的特点,中青年者多为前列腺炎,而老年人则多为前列腺增生(benign prostate hyperplasia BPH)及前列腺癌(prostate cancer PCa),随着年龄的增加,前列腺癌的发病率呈明显增加的趋势。直肠指诊、影像学及活组织检查是诊断前列腺癌的常规手段,然而由于其组织形态学、生物学行为较为复杂,上述方法对前列腺癌的早期诊断仍有一定困难和偏差。分子生物技术的发展已经证明前列腺癌的发生和发展是多种癌基因和抑癌基因共同作用的结果,我们可以从蛋白水平和基因水平检测前列腺癌。通过芯片、免疫组化和RT-PCR分析及比较正常、PCa细胞及组织基因产物表达的蛋白组学研究鉴定出许多有力的可以用于PCa诊断和预后的早期检测的生物标记。前列腺特异性抗原(PSA)作为前列腺癌的肿瘤标志物目前广泛应用于临床,但由于其特异性及敏感性的局限,其在临床的应用亦存在争议。目前研究比较多的前列腺肿瘤分子标记物有前列腺特异膜抗原(PSMA)、A2甲酰基辅酶A2消旋酶(AMACR)、前列腺特异基因DD3、高分子量细胞角蛋白(CK34BE12)、P63、PCa224蛋白、端粒酶和端粒酶逆转录酶(hTERT)、钙磷脂结合蛋白、STEAPs以及谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)甲基化等。但由于其各种局限性,尚未发现比较合适的用于临床诊断的分子标记物,因此寻找新的可靠的前列腺肿瘤多分子联合标记物成为研究的焦点。荧光定量PCR技术因其高灵敏度、特异性、多重扩增及准确定量等优点,而被广泛应用于多个领域的分子生物学研究,包括医学、动物学、农业、国防、检疫等。多分子标记联合使用的准确率以及特异性明显高于单标记诊断,近年来,前列腺组织中NFKBIA/SREBP2基因的生物学活性以及前列腺癌中胆固醇代谢的调节逐步被人们认识,它们有望成为一种新的诊断前列腺癌和评价其恶性程度的指标,并且通过对SREBP在前列腺癌患者中胆固醇、脂肪酸等代谢调节的深入研究,可望为前列腺癌的分子治疗提供一种新的尝试。本文通过对前列腺特异抗原在前列腺癌诊断中的价值进行进一步的分析,利用荧光定量RT-PCR技术对NFKBIA/SREBP2基因在前列腺癌中的表达进行检测,并分析其临床意义,以期明确NFKBIA/SREBP2作为联合分子标记物在前列腺癌诊断中的价值。第一章前列腺特异性抗原对前列腺癌的诊断价值的分析目的：PSA因其较好的特异性和敏感性已成为重要的PCa肿瘤标记物,但随着应用的广泛,其特异性及敏感性亦饱受争议。我们通过对PSA异常患者及PSA正常的PCa患者进行临床分析,进一步揭示PSA对前列腺癌的诊断意义,分析总结PSA不能准确诊断前列腺癌的原因,包括PSA升高患者未能诊断为前列腺癌的原因及诊断为前列腺癌而PSA正常的原因。方法：回顾性分析住院及门诊PCa患者及PSA异常患者的资料。总计患者1475例,919例患者PSA值4.0～14152ng/ml,10例PCa患者PSA正常,所有前列腺癌患者均经病理诊断确诊。标本采集及操作均严格按操作说明进行,血液标本采集后静置离心,分离血清立即检测。采用电化学发光免疫分析法测定PSA数值,正常值参考范围为0～4.0ng/ml。资料采用excel进行收集,计算相关诊断指标,对PSA指标的敏感度等进行描述性统计分析。用SPSS13.0软件对不同病例年龄、体积等指标进行方差检验,并独立性检验分析差异性,列联表做卡方检验,P<≤0.05为存在统计学差异,具有统计意义。结果：患者血清PSA>4.0ng/ml者总计919例,PCal49例,阳性率16.2%；其中PSA值在4.0～10ng/ml者424例,PCa者11例,阳性率2.59%；PSA值在lOng/ml以上者495例,证实为PCa者138例,阳性率27.9%。159例PCa患者中10例患者PSA值低于4.0ng/ml,阴性率为6.3%。本组患者敏感度为93.7%,特异度为41.5%,阳性预测值为16.2%,分别根据不同水平PSA检测的例数及前列腺癌例数显示PSA值越高,检出前列腺癌的比例越高；年龄是引起PSA升高一个重要因素,随着年龄的增加,PSA值有不同程度的升高,而且与黑人、白人甚至亚洲的的韩国、日本人相比,中国人PSA增幅最低。PSA升高患者的前列腺体积分布提示随前列腺体积的增加,其PSA值亦有明显的升高。其它如前列腺炎症、前列腺上皮内瘤、急性尿潴留、经尿道的操作或治疗、药物甚至射精等均可引起PSA的升高。10例PCa患者PSA在正常范围,A、B期的前列腺癌7例,占70.0%。血清PSA水平与病理分期相关,低PSA前列腺癌病理分期明显较高PSA者早,PSA水平越高,Gleason评分值就越高。10例正常水平PSA前列腺癌患者中,Gleason评分值多在2-5分,有8例,6-7分1例,未有发现PSA正常的前列腺癌患者Gleason评分在8-10分。结论：将PSA作为检测前列腺癌重要标记物已广泛应用于临床,但它只具有前列腺组织特异性,而非高度特异性的肿瘤标记物,包括年龄、前列腺增生、前列腺炎症、经尿道膀胱的操作及药物等原因均可引起PSA的升高；另一方面,其它的原因如年龄、家族史、服用非那雄胺类药物、肿瘤体积及病理分期(如高分化癌、小灶癌)等因素又可导致患者诊断为前列腺癌,而PSA却在正常水平。如果临床医生将其作为唯一的手段而忽视特异性及敏感性方面的缺陷,将为临床诊断前列腺癌带来困难。临床为弥补单一PSA测定诊断前列腺癌的缺陷而使用较多的f/tPSA、PSAV、PSAD等措施对提高PSA诊断前列腺癌的特异性虽然能起到一定的辅助作用,但不能从根本上解决PSA本身特异性的缺陷。我们以下的研究目的就是寻找一种具有高效的特异性和敏感性的PCa分子标记物,补充PSA的不足,以期成为PCa早期诊断的重要参考指标。第二章前列腺癌中NFKBIA/SREBP2的表达与意义目的：PSA作为检测前列腺癌重要标记物已广泛应用于临床,但由于受到前列腺增生、炎症、年龄及药物等因素的影响,PSA作为诊断前列腺癌的分子标记物的特异性和敏感性颇受争议。近年来众多学者一直在寻找其它诊断前列腺癌的高特异性的分子标记物。我们根据最近国内外前列腺癌与前列腺增生的基因表达谱和免疫组化研究状况,选择NFKBIA及SREBF2进行研究,期望发现新的诊断前列腺癌和评价其恶性程度的指标,以寻找更高更有效的标记物来提高PCa的早期诊断率。方法：收集临床手术切下的前列腺癌组织或增生组织、穿刺活检组织,液氮速冻收集保存。总计127例患者,PCa患者67例,BPH患者60例,患者平均年龄为66.5岁。选择经过HE鉴定的一的52例PCa样本,以及57例BPH样本行表达水平NFKBIA及SREBF2定量PCR检测。从NCBI的GeneBank数据库中检索各基因的uniGene资料,从中获得各基因的uniSTS。选择长度在100-300 bp、位置近mRNA 3’端的uniSTS序列,并经NCBI网站的Blast软件分析和e-PCR软件确认该片段的特异性。免疫组织化学检测NFKBIA及SREBF2两基因表达蛋白在前列腺癌与前列腺增生组织中的阳性表达率以及阳性表达值,进行x±s统计检验,比较PCa与BPH中表达差异性,评价NFKBIA及SREBF2蛋白表达量与前列腺癌评分及恶性程度的关系。对荧光定量的PCR产物熔解曲线进行分析,同时随机对定量PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳,以确定产物是否为所扩增的目的片段。Ct值与样本的起始拷贝数有着对应的关系,起始拷贝数越高,Ct值越小。一旦确定目标基因(NFKBIA及SREBF2)和内参基因(β-actin)有相似且接近100%的扩增效率,利用Livak (2-ΔΔCt)法计算前列腺癌和对照组中目标基因表达水平的相对差异。用紫外分光光度计测量各基因质粒DNA的0D260值,计算质粒样品的浓度,将质粒DNA浓度换算成质粒样品拷贝数浓度。所得Ct值与加入的质粒DNA含量作浓度关系曲线,以Ct值为纵坐标,加入DNA量为横坐标,ABI 7900HT SDS2.0软件绘制标准曲线。SDS2.0软件导入β-actin的标准曲线-将各样品β-actin基因的Ct值在β-actin的标准曲线上进行表达量定量,以BPH为基准求出相对值。制作各目的基因标准曲线,将不同样品目的基因Ct值在目的基因标准曲线上进行不同样品目的基因表达量定量。再用上述制作标准曲线得到的定量结果除以BPH为基准得到的相对值,校正反应使用的RNA量的误差。根据校正后的定量结果求出样品之间的目的基因的表达量相对值,即mRNA表达量的相对定量。各基因均以BPH对应基因表达为基准,计算该基因在其他样本中的表达变化比值。良性前列腺增生症和前列腺癌的NFKBIA和SREBP2表达量(Ct值)进行独立样本t检验。将肿瘤恶性程度分为G1-G2以及G3两组,Gleason评分分为≤7.0以及>7.0两组。对其肿瘤组织中的NFKBIA和SREBP2表达量(Ct值)进行独立样本的t检验。结果用x±s表示,SPSS 13.0统计学软件对所得数据进行检验,当P≤0.05时为差异有统计学意义。结果：对进行免疫组织化学实验的样本进行阳性结果评分,统计经检测的样本的阳性表达值,对PCa与BPH中的阳性表达情况进行比较发现,NFKBIA蛋白表达量在良性前列腺增生症比前列腺癌的高,而SREBF2蛋白表达量在前列腺癌比良性前列腺增生症高,统计检验P<0.001,具有显著性差异。NFKBIA及SREBF2蛋白表达量的阳性表达值与Gleason评分以及肿瘤恶性程度评价比较发现SREBF2在良性前列腺增生症和前列腺癌中的表达量阳性程度随着Gleason评分以及肿瘤的恶性程度的增加而上升,具有有显著性差异(P≤0.05),而NFKBIA在良性前列腺增生症和前列腺癌中的表达量阳性程度与Gleason评分评分以及肿瘤的恶性程度并不具有显著相关性(P>0.05)。将BPH作为两基因表达的对照组,对比计算PCa中基因NFKBIA和SREBF2的表达率。比较两者的Ct值均数与标准差,经t检验,两者有统计学差异(P≤0.05),NFKBIA基因mRNA表达量在BPH表达量比PCa高,而SREBF2基因mRNA表达量在BPH表达量比PCa低。根据相对定量公式2-△△ct计算,分别得到NFKBIA及SREBF2基因在每例前列腺癌与前列腺增生组样品中的相对表达差异,计算前列腺癌细胞系中基因的相对表达情况,发现前列腺增生(BPH)中NFKBIA和SREBP2基因表达相对于PCa中,NFKBIA表达量为增生的0.099倍,基因表达下调,而SREBP2在PCa中表达为前列腺增生中的34.54倍,表达上调,P≤0.05。SREBP2的PCR检测对PCa敏感度为92.3%,NFKBIA为88.5%,同时进行SREBP2与NFKBIA的PCR检测对PCa诊断敏感度为98.1%。PCR对两个基因联合检测,相关系数为-0.678,P<0.001,提示PCa中SREBP2的上调与NFKBIA的下调相关关系密切。结论：NFKBIA在PCa细胞中的表达下调,表明细胞中NF-KappaB表达活跃,细胞增殖快,在前列腺组织中NFKBIA的低表达可作为前列腺癌早期诊断和预后的个标志物。PCa组织中SREBP2的表达水平明显高于BPH,差异具有统计学意义。研究结果显示SREBP2在PCa细胞中的表达上调,提示脂类生成增加,破坏了胆固醇的动态平衡。NFKBIA/SREBF2为一组与基因的转录水平有关的因子,PCa中SREBP2上调与NFKBIA的下调相关关系密切,且同时SREBP2与NFKBIA的检测对PCa诊断敏感度高于单个SREBP2及NFKBIA检测的的敏感度。将NFKBIA和(?)SREBF2联合起来应用可以增加检测单个基因表达的准确性,有助于临床早期诊断前列腺癌及判断其预后情况。