目前,随着我国居民生活水平的提高,日常饮食结构的改变,糖尿病的发病率日益增高。糖尿病肾脏病(Diabetic Kidney Disease, DKD)作为糖尿病的常见微血管并发症,其发病率亦日益增高,已成为导致终末期肾病的主要原因之一。糖尿病肾脏病的发病主要与高血糖导致的肾脏血流动力学改变、氧化应激、细胞凋亡以及一些细胞因子的异常表达有关,但糖尿病肾脏病的发病机制较复杂,目前尚无特效疗法。患者一旦进入临床糖尿病肾脏病期,病情将不可逆发展。目前关于氧化应激在糖尿病肾脏病发病机制中的研究较多。糖尿病时的高血糖状态可以导致肾小管上皮细胞、系膜细胞、毛细血管内皮细胞等肾脏细胞及机体其他组织细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生过多,抗氧化能力降低,从而导致机体氧化应激水平增强。由于ROS的反应性化学特征,它们可以直接氧化损伤DNA、蛋白质、脂类及碳水化合物等大分子物质。此外,ROS还可以作为信号分子激活一系列的细胞应激敏感性通路导致细胞损伤。研究证实糖尿病肾脏病时积极的血糖控制及ARB类药物的应用部分亦是通过抗氧化应激效应实现其肾脏保护作用。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)作为一种主要由肾脏成纤维样细胞(I型间质细胞)分泌合成的糖蛋白激素,通过与其特异性受体(Erythropoietin receptor, EPOR)结合而发挥促红细胞生成作用。但近年来的研究发现,机体的一些非造血组织亦表达EPOR,如神经元细胞、胃上皮细胞、睾丸间质细胞及肾脏系膜细胞等。进一步的研究证实,EPO可以对上述组织细胞发挥非血液学的生理作用。值得注意的是,EPO的主要分泌细胞肾脏成纤维样细胞与近端、远端肾小管上皮细胞基底面直接接触。我们有理由相信,由于成纤维样细胞与肾小管细胞、毛细血管内皮细胞及其他肾脏细胞在解剖结构上的关系,使得EPO在肾脏内更利于发挥其内分泌和旁分泌作用。所以本实验中,我们通过体外、体内实验检测大鼠近端肾小管上皮细胞是否表达EPOR,并进一步研究EPO对糖尿病大鼠模型是否具有肾脏保护作用。结果体外实验发现,大鼠近端肾小管上皮细胞表达EPOR,且高糖环境下EPOR表达增高。进一步的研究证实,高糖可以导致肾小管上皮细胞内氧化应激水平升高,诱导细胞凋亡。而EPO可以缓解高糖所诱导的氧化应激水平,抑制肾小管上皮细胞凋亡。随后我们通过链脲菌素诱导糖尿病大鼠模型,进一步研究EPO对糖尿病大鼠的肾脏保护作用。结果证实,肾小管细胞、系膜细胞等肾脏细胞均表达EPOR,但糖尿病组与正常对照组肾脏EPOR表达并无差异。这与体外实验结果不一致,考虑可能与体内复杂的生理环境有关。进一步的实验证实,糖尿病大鼠肾脏的氧化应激水平升高,转化生长因子β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)表达增高,而低剂量的EPO可以缓解大鼠肾脏氧化应激水平,降低TGF-β1、FN表达,缓解肾脏病理及功能损伤。综上所述,作为主要由肾皮质成纤维样细胞分泌的糖蛋白激素,EPO可以抑制高糖诱导的氧化应激和肾小管上皮细胞凋亡,而且EPO可降低糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平,下调TGF-β1表达,发挥肾脏保护作用。这提高了我们对EPO生理作用的传统认识,也为DKD防治提供了新的思路,但动物实验不能完全模拟复杂的人体环境,特别是不能忽视EPO所可能引起的高血压、促肿瘤生长等不良作用,因此对于EPO的肾脏保护作用还有待于大量临床实验证实。第一部分高糖环境下肾小管细胞促红细胞生成素受体的表达目的检测大鼠近端肾小管上皮细胞是否表达促红细胞生成素受体(Erythropoietin receptor, EPOR),并研究高糖对肾小管上皮细胞EPOR表达的影响。方法传代培养大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常对照组(NC组)、渗透浓度对照组(OC组)、高糖组(HG组)。免疫荧光检测NRK-52E细胞有无EPOR表达。1RT-PCR及Western blot检测高糖对NRK-52E细胞EPOR mRNA及蛋白表达的影响。结果(1)免疫荧光显示肾小管上皮细胞表达EPOR,且EPOR主要表达于肾小管上皮细胞的胞膜及胞浆中(2)RT-PCR示高糖可诱导肾小管上皮细胞EPORmRNA表达水平增高,相同渗透浓度的甘露醇不影响EPOR mRNA表达。(3)Western blot示高糖可诱导肾小管上皮细胞EPOR蛋白表达水平增高,相同渗透浓度的甘露醇不影响EPOR蛋白表达。结论大鼠近端肾小管上皮细胞表达EPOR,且高糖可诱导肾小管上皮细胞EPOR表达水平增高。第二部分促红细胞生成素对高糖诱导肾小管细胞凋亡的影响目的探讨促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是否可以抑制高糖诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡及其抑制凋亡的相关机制。方法传代培养大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常对照组(NC组)、渗透浓度对照组(OC组)、高糖组(HG组)、高糖+EPO (50U/ml)组(E1组)和高糖+EPO (100U/ml)组(E2组)。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡指数。荧光探针CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的水平。RT-PCR检测bcl-2/bax、Capases-3mRNA的表达。Western blot检测bcl-2/bax蛋白的表达,Capases-3活性检测试剂盒检测Capases-3活性。结果(1)高糖可诱导NRK-52E细胞凋亡,与葡萄糖相同渗透浓度的甘露醇不能明显诱导细胞凋亡。E1、E2组细胞早、晚期凋亡率显著低于HG组[E1组(5.7%±0.8%)/(2.9%±0.5%), E2组(3.5%±0.7%)／(1.5%±0.3%)比HG组(7.9%±1.0%/(5.5%±0.6%),P<0.05]。(2)高糖刺激后,NRK-52E细胞内ROS产生增多,EPO可抑制高糖诱导的ROS的产生。(3)高糖下调NRK-52E细胞bcl-2mRNA及蛋白的表达,上调bax mRNA及蛋白的表达。EPO可以抑制高糖的上述作用。(4)高糖上调NRK-52E细胞Caspase-3mRNA表达,增强Caspase-3活性。EPO可抑制高糖诱导的Caspase-3mRNA表达的上调,降低Caspase-3活性。结论EPO可缓解高糖诱导的氧化应激,上调bcl-2表达,下调bax表达,降低Caspase-3活性,抑制NRK-52E细胞凋亡。第三部分促红细胞生成素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用目的观察促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是否对糖尿病大鼠具有肾脏保护作用,并探讨其发挥肾脏保护作用的可能机制。方法腹腔注射链脲菌素制备糖尿病大鼠模型,将实验大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病模型组(DM组)和EPO治疗组(DE组)。药物干预8周后,处死大鼠,检测尿白蛋白排泄率(UAER)、血清肌酐(Scr)、红细胞压积(Hct)。肾组织切片HE、PAS染色观察大鼠肾脏病理改变。化学比色法检测肾脏丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)。免疫荧光及Western blot检测大鼠肾脏EPO受体(Erythropoietin receptor, EPOR)的表达。免疫组织化学及Western blot检测大鼠肾脏NADPH氧化酶亚基(P47pho)、转化生长因子β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)的表达。结果EPO可以减轻糖尿病大鼠肾脏病理及功能损伤。各组大鼠肾脏均表达EPOR,但表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组比较,DM组大鼠P47phox表达增加(P<0.01),MDA含量增加(P<0.01),GSH-Px、SOD活性及T-AOC下降(P<0.01),TGF-β1、FN蛋白表达增强(P<0.01)。与DM组相比,DE组大鼠P47phox表达减弱(P<0.05),MDA含量降低(P<0.01),GSH-Px、 SOD活性及T-AOC升高(P<0.01)，TGF-β1、FN蛋白表达减弱(P<0.01)。结论EPO可抑制糖尿病大鼠肾脏氧化应激,降低TGF-β1、FN表达,减轻糖尿病大鼠肾脏病理及功能损伤,发挥肾脏保护作用。