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糖尿病视网膜病变(DR)是常见且严重的糖尿病微血管并发症,是四大致盲的主要原因之一,因此阐明DR的发病机制并寻找有效的防治方法日益引起人们的重视。视网膜微血管主要由内皮细胞和周细胞构成,选择性视网膜微血管周细胞消失是DR的最早期病理特征。长期慢性高糖引发的晚期糖基化终产物(AGE)积聚是导致DR周细胞丢失的主要原因,转化生长因子(TGF-β) 及氧化应激参与了AGE的致病机制,抗氧化剂银杏叶对糖尿病微血管并发症有一定预防和治疗作用。因此,研究DR时AGE对周细胞的致病机制并探讨银杏叶对DR的保护作用具有重要意义。本实验体外采用两次筛网过滤结合除杂的方法建立牛视网膜微血管周细胞的原代培养,应用MTT法,流式细胞技术及免疫荧光染色技术,观察AGE作用下及银杏叶治疗后,周细胞的增殖、细胞周期、凋亡细胞数及TGF-β的表达。体内动物实验通过多次小剂量注射STZ诱发1型糖尿病大鼠模型,采用视网膜铺片的方法观察正常对照组、DM组和银杏叶治疗组周细胞的丢失情况,并在铺片上进行免疫组化染色观察了周细胞TGF-β的表达改变。实验结果如下:1. 采用相差显微镜,免疫细胞化学染色及透射电镜技术联合鉴定视网膜微血管周细胞,纯度达95%以上。周细胞具有多形性,生长缓慢,表面有突起,非接触抑制的重叠状排列,α-SMA抗体染色阳性,Ⅷ因子相关抗原抗体染色阴性。电镜下可见周细胞核大,核内见多个核仁,细胞表面有微绒毛,胞质内可见粗面内质网、线粒体、高尔基复合体、游离核糖体和微丝等细胞器,且无Ⅷ因子小体。2. AGE条件培养液作用24h后,可见AGE抑制周细胞的增殖,并呈<WP=41>剂量依赖性。AGE使周细胞S期(38.49±1.65%)细胞增多,G2-M期(0.90±0.44%)细胞减少,凋亡细胞数(13.73±1.80%)显著增多(P<0.01),免疫荧光染色可见周细胞TGF-β呈强阳性表达。3. 银杏叶呈剂量依赖性促进100μg/ml AGE培养条件下周细胞的增殖。银杏叶可抑制AGE对周细胞细胞周期的影响,减少凋亡细胞数(P<0.01),使周细胞TGF-β表达降低。4. DM大鼠血糖和血清AGE含量明显高于正常对照组(P<0.01)。视网膜铺片可见,毛细血管迂曲,走行不规则,管径粗细不一,闭塞毛细血管形成 ,内皮细胞增生,周细胞数量显著减少(P<0.01)。周细胞TGF-β过度表达(P<0.01),并且周细胞丢失与血清AGE含量呈正相关(P<0.01)。 5. 银杏叶治疗后视网膜铺片可见,毛细血管比较规则,粗细比较均匀,无明显扭曲扩张,未见毛细血管闭塞,周细胞丢失较DM组有所减少,但无明显统计学意义(P>0.05)。银杏叶能降低DM大鼠周细胞TGF-β的表达(P<0.01)。实验结果表明,AGE抑制体外培养的牛视网膜微血管周细胞的生长,使细胞周期阻滞于S期,并能促进TGF-β的表达,银杏叶可抑制AGE对周细胞增殖、细胞周期及TGF-β表达的影响。DR周细胞丢失不仅与AGE密切相关,也可能与周细胞TGF-β过度表达有关,银杏叶能降低DM大鼠周细胞TGF-β的表达,抑制视网膜微血管病变的形成,对DR有一定的保护作用,但降糖作用不明显。总之AGE通过多种途径参与DR周细胞的丢失,氧化应激增加及TGF-β过度表达可能是AGE作用途径的主要环节。本实验为进一步探讨AGE在DR中的作用机制及银杏叶对DR的防治作用提供了一定的理论和实验依据。