论文部分内容阅读
5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，简称ALA）是生物合成四吡咯的前体，而四吡咯是构成生物体必不可少的物质(血红素，细胞色素，维生素B12)。对ALA的深入研究表明，ALA对人畜无毒性，在环境中易降解、无残留，是一种无公害的绿色农用化学品。在医学领域，ALA可作为抗癌药物的中间体，作为检验铅中毒的主要试剂，对吡咯紫质沉着症的临床诊断也有一定效果。1999年12月，美国FDA正式批准ALA为治疗皮肤癌前期的光动力药物，ALA在治疗其它表皮癌症中的应用也得到了越来越多科学家的兴趣。作为第二代光动力药，ALA的显著优点是副作用小、渗透性好、疗效确切、对疾病的适用范围广及价格低等。 国外已经研究了采用化学方法以及微生物发酵合成ALA的各种工艺路线。我国对化学方法以及微生物发酵法生产ALA的研究基本上仍属空白。 本论文对5—氨基乙酰丙酸的生物合成展开研究，主要包括光合细菌的筛选和诱变育种，光合细菌摇瓶发酵的研究，基因工程菌摇瓶条件和发酵罐上的研究。 我们利用van Niel培养基从杭州市四堡废水处理厂的活性污泥中分离得到四株光合细菌，选取其中产生ALA能力最佳的菌株（ALA产生能力为7.35mg／L）进行菌种鉴定，确定该菌株属红假单胞菌属。采用亚硝基胍，紫外线以及磷酸二乙酯和氯化锂协同作用对该菌株进行诱变处理，得到产量为21.2mg／L的菌株C-2。 对培养基组成和培养条件进行了初步优化，发现葡萄糖是最佳碳源、磷酸铵为最佳氮源。在培养基中加入的葡萄糖质量浓度为15g／L、磷酸铵质量浓度为2g／L、接种量为10％、100mL摇瓶装液量为20mL、调节初始pH7.0进行培养时，ALA的最高积累量可达24.9mg／L；进一步对前体的最佳添加量进行优化，发现甘氨酸的最佳添加浓度为100mmol／L、琥珀酸的最佳浓度为20mmol／L，同时加入脱水酶抑制剂乙酰丙酸20mmol／L时，ALA的最高产量达到38.9mg／L。 由于常规诱变工作量大，效率低。通过几轮诱变后发现进一步提高光合细菌产ALA的能力十分困难，于是本实验室构建了以E.coli DH5α为宿主的工程菌GT48，产ALA能力为19.8mg／L的，在摇瓶条件下对GT48菌株的培养特性进行了浙江大学硕士学位论文暴摘要初步考察，结果表明:最佳的初始pH为6.5，最佳诱导时间为稳定前期，适当的葡萄搪浓度对ALA的积累有较大的促进作用。确定甘氨酸的加入对于ALA的积累有一定效果。随后在高百特5L罐上研究了丑co了z’GT48的间歇培养规律。把产ALA能力提高到47.smg/L。 为了进一步提高细胞密度及ALA产量，在5L高百特发酵罐中进行了流加培养，探讨了不同流加培养基，发酵罐溶氧对大肠杆菌累积ALA的影响。最终确定以恒定的流速向发酵罐中流加补料时，流加速度为smL/hr（相当于每小时加入1g葡萄糖和0.59甘氨酸），发酵罐装液量为3L，通气量为svvm，ALA的累积量达到72.gmg/L。 本文工作只是对生物合成5一氨基己酞丙酸的初步探索，结果也不尽如人意，但为5一氨基乙酞丙酸的深入研究打下了基础。