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猪肝羧酸酯酶(pig liver carboxylesterase,PLE)是一个由多种同工酶组成的酶家族,它存在于猪的肝脏中。从猪体内直接提取的PLE是多种同工酶的混合物,且不同批次提取物的成分和活性差异较大。到目前为止,文献报道的PLE有7种亚型,分别为PLE1,PLE2,PLE3,PLE4,PLE5,PLE6以及APLE。PLE具有高度的立体选择性,在水解对映异构体的反应中能选择性地水解其中的一种,获得单一的对映体产物,在功能性单一对映体化合物和药物中间体工业生产中起到重要的作用,因而在有机化学合成领域扮演重要的角色。本研究早期的研究表明,在通城猪和大白猪肝脏中有多种PLE同工酶存在,它们的表达丰度和表达水平与年龄及品种显著相关。本研究通过对PLE主要亚型进行原核功能性表达,获得PLE重组蛋白,测定PLE重组蛋白对通用底物和特异性底物的水解活力,获得PLE同工酶的水解特征,为进行PLE水解兽药的研究提供理论依据。又选取PLE同工酶中氨基酸差异最小且酶活力差异最大的亚型,进行基因定点突变,寻找影响酶活性大小的关键氨基酸,探讨影响PLE水解活性的决定因素。本研究在克隆得到多种PLE同工酶c DNA的基础上,通过对PLE的表达丰度分析,筛选出PLE同工酶中的主要亚型PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE、PLE12、PLE13、PLE18,对其进行原核功能性表达。依据Gen Bank中PLE1c DNA序列设计引物。上游引物从去除信号肽之后的核苷酸序列开始,5’端依次加上7个保护性碱基GGAATTC和Nde I酶切位点CATATG;下游引物去除编码内质网滞留信号的12个核苷酸(CATGCTGAGCTG),5’端依次加入3个保护性碱基CCG、Xho I酶切位点CTCGAG和终止密码子TCA。用课题组前期构建的重组p MD18T-PLE为模板,用上述引物扩增PLE的ORF。将PLE基因插入到表达载体p ET15b上,构建p ET15b-PLE原核表达载体。将构建的表达载体与分子伴侣质粒p Gro7在Origami?2(DE3)中进行共表达。首先加入L-阿拉伯糖(L-Arabinose)诱导p Gro7表达,接着加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导PLE表达。诱导后离心集菌,破碎菌体收集上清液,用镍离子亲和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE电泳分析PLE蛋白。用通用底物对硝基苯基乙酸酯(p-NPA)检测纯化PLE的水解活性,重组PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE、PLE12、PLE13、PLE18水解p-NPA的活力分别为:3.5U/mg、1.75 U/mg、1.19 U/mg、1.41 U/mg、1.78 U/mg、6.72 U/mg、2.91 U/mg、1.83 U/mg、1.73 U/mg、1.71 U/mg。用自动电位滴定仪测定PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE对特异性底物丁酸甲酯和丁酸己酯的活性,发现PLE1,PLE2,PLE3,PLE4,APLE优先水解丁酸甲酯,而PLE5,PLE6优先水解丁酸己酯。笔者对所有已见报道的PLE亚型和本研究新发现的PLE亚型(数据尚未发表)进行分析,发现所有亚型都具有相同的活性中心即催化三联体(Ser204-Glu336-His449)。但前述研究结果显示不同的同工酶水解活力存在差异,表明PLE的活性中心并不能完全决定酶活力的高低,于是笔者对存在于活性中心以外的可能影响因素进行了研究。本研究前期研究共克隆到54种同工酶(已见报道的有7种),根据同工酶氨基酸序列的相似度将其分为七大类,用大写字母A~G代表,每一大类型用阿拉伯数字进行区别。从上述54种同工酶中筛选出5组彼此之间氨基酸差异最小的同工酶,为PLE-A8/PLE-A9、PLE-C2/PLE-C3、PLE-D4/PLE-D5、PLE-F3/PLE-F4、PLE-G6/PLE-G7,分别进行原核功能性表达。测定它们对p-NPA的酶活力分别为:1.17U/mg/5.9U/mg、0.99 U/mg/0.63U/mg、40.27U/mg/0.83U/mg、7.84U/mg/13.29U/mg、1.57U/mg/0.8U/mg,发现PLE-D4/PLE-D5这组亚型中酶活力相差最大。对PLE-D4和PLE-D5氨基酸全序列进行比对,发现两者间共有4个氨基酸不同,分别位于43、92、150、305位。以PLE-D4、PLE-D5为模板对这4个位置的氨基酸分别进行定点突变,获得8种突变体。对突变体进行原核功能性表达,测定PLE-D4的4种突变体L43P、T92I、A150D、M305V对p-NPA的酶活力分别为:0.48 U/mg、7.68 U/mg、1.07 U/mg、2.85 U/mg,酶活性相比PLE-D4的40.27 U/mg分别降低84.5倍、5.2倍、37.7倍、14.1倍。PLE-D5的4种突变体P43L、I92T、D150A、V305M对p-NPA的酶活力分别为:1.33 U/mg、2.0 U/mg、0.38 U/mg、0.57 U/mg,酶活性相比PLE-D5的0.83 U/mg,P43L、I92T分别升高1.6倍、2.4倍,D150A、V305M分别降低2.2倍、1.5倍。通过突变体活力分析发现PLE-D4的43位亮氨酸L和92位苏氨酸T能够显著提高PLE对通用底物p-NPA的活力,可作为定点突变提高PLE活力的靶点。